Trap-Free 2DLC Q-TOF 定性分析宫缩抑制剂阿托西班中的多聚体杂质

本实验采用岛津二维液相和四极杆飞行时间质谱联用仪Trap-Free 2DLC+LCMS-9030对多肽药物阿托西班中的多聚体杂质进行定性分析。测试结果使用岛津Labsolutions Insight Explore软件对杂质的分子式进行预测，结果显示阿托西班二聚体和三聚体的MS1的离子质荷比同理论值均小于1 mDa。使用Insight Explore软件中解卷积功能预测目标物的分子量，预测分子量和理论分子量的误差小于3 ppm。SSL-CA23-070Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-053 Trap-Free 2DLC Q-TOF 定性分析宫缩抑制 剂阿托西班中的多聚体杂质 LCMS-QTOF-053 摘要：本文采用岛津二维液相和四极杆飞行时间质谱联用仪 Trap-Free 2DLC +LCMS-9030 对多肽药物阿托 西班中的单体和多聚体杂质进行定性分析。测 试结果使用岛津 Labsolutions Insight Explore 软件对杂质的分 子式进行预 测 ，结果显示阿托西班单体、二聚体和三聚体的 MS' 的离子质荷比同理论值均小于 1 mDa。使用 Insight Explore 软件中解卷积功能预测目标物的分子量，预测分子量和理论分子量的误差小于3 ppm。 关键词： Trap-Free 2DLC+LCMS-9030阿托西班 多聚体杂质 技术特点： 心利用 Trap-Free 2DLC Q-TOF联用系统分析阿托西班中的多聚体杂质，可 实现一维和二维不同流动相直接转换，也能避免液相色谱直接分析浓度过高而导致的质谱信号饱的问题 。 阿托西班是一种合成的多肽类物质，其作用机制 是与催产素竞争子宫肌层、蜕膜、胎膜上的催产素受 体，拮抗催产素作用，从而达到抑 制 子宫收缩的作用 可 在受体水平对人催产 素 产生竞争性 抑制 作用。在临 床中，常用于治疗孕期早产 。 杂质研究是药物质量研究的一项重要内容，是药 物质量保证的关键因素之一。为了提高临床用药安全，需对合成过程中产生的工艺杂质和储存过程中产生的 降解杂质进行了详细的研究。由于托西班化学结构特 性，其在 生 产和储存过程中可能产生杂质，而这些杂 质可能引起过敏反应、毒性及其他不良反应。 针对多肽药物中的由两个或多个多肽组成的稳定 的多聚体杂质，可利用体积排阻色谱法 (SEC) 分离 相关杂质。本文采用岛津二维液相和四极杆飞行时间 质谱联用仪 Trap-free 2DLC+LCMS-9030， 既能避免 SEC 的色谱条件于质谱离子源不匹配，也能有效解决 液相色谱分析浓度过高而导致 的 质谱信 号 饱的问题。本文成功对 阿 托西班多肽药物中的多聚杂质进行定性 确证，为相关检 测 人员提供参考。 实验部分 1.1仪器 岛津 Trap-free 2DLC+LCMS-9030四极杆飞行质谱联用仪系统。具体配置为 系统控制器 CBM-20A 脱 气 机：DGU-20A5R 输液泵 LC-20ADXR×4自动进样器：SIL -20ACXR 柱温箱 CTO-20AC 质 谱 仪：LCMS-9030检测器A SPD-M20A 检测器B：SPD-20A 切 换 阀：FCV-32AH2×2色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 一维液相色谱条件： 色谱柱 ： SHIMSEN Ankylo SEC -150 (300 mm×7.8 mm l.D.， 3.0 um，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：380-01215-04) 流 流 ： 0.3 mL/min 柱 进 动 相 水：异丙醇：乙酸 (150/150/200，V/V/V)速 温 样 量 ：10uL 30°℃ 洗脱方式： 等度洗脱 二维液相色谱条件： 色谱 普 ：Shim-Pack GISS C18 (100 mm×2.1 mm l .D.，1.9 um，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-30048-02) 流 动相： A相-0.5%乙酸水 B相-乙腈 流 充 速：0.3 mL/min 柱 温：30℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1梯 度洗脱时间程 序 Time(min) Module Command Value 31.60 柱温箱 CTO.RVR 0* 31.70 柱温箱 CTO.RVR 1* 34.50 泵 B.Conc3 10 50.00 泵 B.Conc3 90 52.00 泵 B.Conc3 90 52.10 泵 B.Conc3 10 60.00 控制器 Stop 注：*“0”表示流路切換至捕集定 量 环，流 路 切 换的时间根据一维液相色谱的保留时间变化；“1”表 表示 一 维流路直接进废液， LCMS-9030 质谱条件： 离 子 源 ：ESI (+)接口电压：4.5kV 加热模块温度：400°℃雾化气流速：3.0 L/min DL温 度 ：300℃干燥气流速 束 ：10.0 L/min 接 妾口温度：300°℃加热气流速：10.0 L/min 碰 撞 气：氩气扫描模式：MS 1.3样品前处理方法 准确称取多肽样品约5 mg， 加入一维流动相1.6 mL 振摇溶解后，上机分析 。 ■结果与讨论 2.1 Trap-Free 2DLC系统介绍 Trap-Free 2DLC 系统是一套支持在线流动相转换的二维液相与色谱-质谱联用仪的组合系统，系统结构示 意图见图1。本系统的第一维液相色谱系统，可使用非挥发性流动相或者与质谱分析不匹配的流动相体系，通 过系统中切换阀、程序命令的组合，对第一维液相色谱系统分离的组分进行分馏。本系统的第二维液相色谱系统，可以采用适合 LCMS 分析的液相色谱条件，针对分馏的组分，进行 针 对性 的 质量分析。 图1 T r ap-free 2DLC Q-TOF 系统的原理图 样品分析过程： 1)第一维 HPLC， 使用 PDA 检 测 器检 测 杂质，已杂质峰的保留时间为指标，将目标组分分馏至样品环。 2)：样品环，在样品环1-5内保留分馏后的组分。样品环6用于第一维与第二维的流动相置换。 3)第二维LCMS，利用第二维的色谱柱分离样品环内的组分后，使用UV检测器和 MS 检测器进行检测。2.2多肽样品一维 SEC 色谱图 首先样品通过一维液相色谱分析，确认各目标物的出峰时间。根据分子排阻色谱的原理，目标化合物依据分 子 的体积大小而分离，样品按照分子量由大到小的顺序出峰。在 阿 托西班样品的一维液相色谱图中可以看到单 体及多聚体的色谱峰，其中 单 体(峰 3)的出峰时间最晚，出 峰时间更早的峰1、2为不同分子量的杂质。 图2 阿托西班样品一维液相色谱图 2.3通过 MS'质谱图定性多聚体杂质 由于一维 SEC 分析的流动相中含有40%乙 酸 ，不能直接应用于质谱分析中。使用 Trap-free 2DLC 系统，可以针对性分馏目标组分，然后用于质谱匹配的流动相条件进行分离分析，并于质谱联用进行质量分析。针对 不同分馏组分，需 要根据分析目标 峰 的一维 SEC 分离的保留时间修改对应的时间程序 。 2.3.1阿托西班二聚体杂质 根据阿托西班二聚体在一维液相色谱中的保留时间，更新时间程序中的阀切换使时间。二维液相 UV 色谱图 和 MS'总离子流色谱图如图3所示，二聚体杂质的出峰时间约为42.5 min。因为一维色谱的流动相中异丙醇和 乙酸的比例较高，二维液相色谱峰出现 了 明显的前沿峰。阿 托西班二聚体平均质谱图见图4，可以分别观察到 带双电荷和三电荷的分子离子峰。 图3 阿托西班 二 聚体 二 维液相 UV色谱图(A)和 M S '总离子流色谱图(B ) 图4 阿托 西 班 二 聚体的平均质谱图 使用 Insight Explore 软件中分子式预测功能对分子离子峰基于准确分子量和同位素丰度比进行预测 ，预测 结果显示，阿托西班二聚体的 [M+2H]2+的质荷比误差为 0.09 mDa， [M+3H]3+的质荷比误差为-0.19 mDa， 相 对偏差均小于 1 ppm。 59.94 1986.88272 994.44864 994.44858 -0.06C 95 H33 N O36 S 7 [M +2... -0.060 55.49 图5 阿托西 班 二聚体的[M+2H]2+峰分 子 式预测 结 果 3.01 图 6 阿托西班二聚体的[M+3H]*峰分 子 式预测结果 使用 Insight Explore 软件中解卷积功能预测阿托西 班 二聚体的分子量，如图7所示，预测结果显示，阿托 西班二聚体的预 测 分子量为 1987.88611，误差为-3.58mDa，相对偏差为-1.80 ppm。 图77阿托 西班二聚 体 解卷积分析结果 2.3.2阿托西班三聚体 根据阿托西班二聚体在一维液相色谱中的保留时间，更新时间程序中的阀切换使时间。二维液相色谱和 MS1总离 子 流色谱图如图8所示，三聚体杂质的保留时间约为42.7 min。因为一维色谱的流动相中异丙醇和 乙 酸的 比例较高，二维液相色谱峰出现了前沿峰。阿托西班三聚体杂质的平均质谱图见图9，可以分别观察到带双电荷、三电荷的分子离子峰。 图8阿托西班 三 聚体 二 维液相色谱图(A)和MS'总离子流色谱图 图 (B) 1：M S(+) RT ：[42.581-42.758] 1.93e5 图9阿 托 西 班三聚体 的 MS'质谱图 使用 Insight Explore 软件中分子式预测功能对分子离子峰基于准确分子量和同位素丰度比进行预测 ，预测 结果显示，阿托西班三聚体的 [M+2H ]2+的质荷比误差为-0.087 mDa， [M+3H]3+的质荷比误差为-0.151 mDa，相对偏差均小于 1 ppm。 97.152980.32364 1491.16910 1491.16896 -0.14C 131 H 213 N 19 046 S 6 [M +2... -0.094 96.85 35.0 96.522980.32432 1491.16944 1491.16896 -0.48C 124 H 213 N 25 O 44 S 7 [M +2... -0.322 96.27 31.0 图10 阿托西班三聚体的 [M+2H]2+峰分子式预测结果 59.96 图 11 阿托西班 三 聚体的 [M+3H ]3+峰分子式预测结果 使用 Insight Explore 软件中解卷积功能预测阿托西班三聚体的分子量，如图17所示，预测结果显示，阿托 西班三聚体的预 测 分子量为 2980.32690，误差为3.27mDa，相对偏差为 1.10 ppm。 2 994.78299 3 2981.32712 图12 阿托西 班 三聚体解卷积分析结果 ■结论 本实验采用岛津二维液相和四极杆飞行时间质谱联用仪 Trap-Free 2DLC+LCMS-9030 对多肽药物阿托西班 中 的多聚体杂质进行定性分析。测试结果使用岛津 Labsolutions Insight Explore 软件对杂质的分子式进行预测，结果显示 阿 托西班二聚体和三聚体的 MS' 的 离子质荷比同理论值均小于1 mDa。使用 Insight Explore 软件中解 卷积功能预测目标物的分子量，预测分子量和理论分子量的误差小于3ppm。 岛津应用云