二维离子色谱法测定厄贝沙坦中叠氮化物含量

采用岛津公司IC-16离子色谱仪，参考2020版《中国药典》建立了二维离子色谱法测定厄贝沙坦中叠氮根含量的方法。该方法线性关系良好，相关系数r大于0.999，精密度、准确度均符合标准，可以为厄贝沙坦中叠氮根杂质含量测定提供参考。SSL-CA23-014Excellence in Science Excellence in ScienceLC-369 LC-369 摘要：本文参考2020版《中国药典》厄贝沙坦中叠氮化物含量测定要求，使用岛津 IC-16搭建了二维离子色 谱系统并建立对应离子色谱分析方法。该方法在0.04-1.00 mg/L 浓度范围内叠氮化物线性关系良好，相关系 数 r大 于 0.999。将低、中、高浓度对照品重复进样6次，保留时间RSD 值在 0.016%-0.031%之间，峰 面积 RSD 值在0.425%-1.062%之间，仪器精密度良好。准确 度 在90.7%-95.0%之 间 。实验结果表明，该方法能稳定、准确地测定厄贝沙坦中叠氮化物含量。 关键词：：二维离 子 色谱 阀切换在线基体消除法 厄贝沙坦 旦 叠氮化物 技术特点： 心使用阀切换基体消除法，去除样品基质同 时 富集痕量 待 测杂质离子。 *采用岛津 SAG-1000 淋洗液发生器，轻松进行梯度洗脱。 厄贝沙坦 (irbesartan) ，用于治疗原发 性 高血压，合并高血压的2型糖尿病肾病的治疗。沙坦类降压药具 有降压效果明确、心肾作用好、不良反应少等特点，是 一种被广泛应用的 降 压药。2021年4月29日，欧洲药 品质量管理局 (European Medicine， EQA) 宣 布含四 唑环沙坦类原料药中可能含有叠氮化杂质，该毒性杂质 有引起细胞 DNA 突变的危险，厄贝沙坦也在其中。 叠氮化物是药品合成中常用的物质之一，与亚硝基 杂质相比，叠氮杂质具有更高的毒性。体外研究显示叠 实验部分 1.1仪器 岛津IC-16二维离子色谱系统。具体配置为： 系统控制器 CBM-20Alite 淋洗液发生器 SAG-1000输液泵 LC-16i×2自动进样器 SIL-16i 柱温 品 箱 CTO-20AC 检 测 器 CDD-10A v P 抑制器 AS-1000色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.109 1.2分析条件 氮化物有抑制相关生物酶、阻断体内氧气及血红蛋白 的 形成，1以及黏膜刺激性、中枢神经损伤等 毒性 。因此，在药物生产和质量控制过程中应严格对 叠 氮化物杂质含 量进行检测 。2020版《中国药典》中，厄贝沙坦原料 药中叠氮化物含量采用离子色谱法进行检测，通过阀切 换基体消除法对供试品溶液进样后进行在线处理。 本实验使用岛津 IC-16搭建二维离子色谱分析系统，参照2020版《中国药典》，建立了二维离子色谱法测 定厄贝沙坦中叠氮化物的含量。 第一维预处 理 柱 ： Shim-pack Scepter C18-120 (50 mm x2.1 mml.D.， 3 um， 岛津 (上海))实验器材有限公司 ， P/N：227-31073-01) 第一维富集柱： Shodex IC SI -90G (10 mmx4.6mm l.D.， 9 um，岛津(上海)实验器材有限公司 ， P/N： F6709620) 第一维流动相 ：A-ACN A相流速：：0.5 mL/min ：B-H2O B相流 速：0.5 mL/min 第二维分离柱： 阴离子交换色谱柱，固定相为烷基季铵基 ((250 mm x4.0 mm l.D.， 5.5 um) 第二维流动相 ： KOH 溶液 流 速： 0.7 mL/min 脱方 式 梯度洗脱，，初始淋洗液浓度为9mM，时 间程 序 见表1。样体 积 ： 100 uL 柱 温 ： 15℃ 抑制器电流： 56mA 阀切换程序： 阀切换时间程序见表2。 表1 淋洗液梯度程序设置 Time (min) Concentration (mM) 0 9 26 9 26.1 40 32 40 32.1 9 45 9 表2阀切换时间程 序 设置 Time (min) Module Command Value 3 柱温箱 CTO.RVR 1 3 泵 SV(Pump B) A 40 泵 SV(Pump B) B 43 柱温箱 CTO.RVR 0 45 控制器 Stop 备注：一维泵 的 初始 状 态为 100%B；流路切换阀的初始状态为“0”号 位。 样品前处理 供试品溶液：取厄贝沙坦样品，精密称定，加90%甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含20 mg的溶液。 对照品溶液：取 叠 氮 化钠对照品，精密称定，加90%甲醇溶液溶解并定量稀释制 成 0.04、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/L 的叠氮化钠对照品溶液，其中0.20 mg/L 叠氮化钠对照品溶液为药典中规定的对照品浓度。 系统适用性溶液：取溴化钾、叠氮化钠和硝酸钾各适量，加90%甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含 0.2 ug 的混合溶液。 结果与讨论 3.1岛津IC-16二维离子色谱系统原理介绍 岛津IC -16二维离子色谱阀切换系统工作流程如图1所 示 。样品分析从样品取样开始，样品由自动进样器取样。带有低压梯度比例阀的输液泵 (LC-16))设置为输送水相，当厄贝沙坦样品随超纯水进入预处理柱 时 ，厄贝沙坦 被保留，在预处理柱上无保留的叠氮根及其他杂质离子随超纯水进入富集柱。六通阀位置切换，进行分离测定。采用岛津 SAG -1000 淋洗液发 生 器，对保留在富集柱 上 的叠氮根及其他杂质离子进行梯度洗脱分离，同时另一 侧将超纯水切换为乙腈对预处理柱进行清洗。通 过六通阀的切换，在去除样品基质的同时富集痕量待测离子，提高了样品的分析准确性。 上样过程 图 1 阀 切换系统流路图 3.2系统适用性及专属性 系统适用性溶液色谱图中，连续进样五 针 ，叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度均大于1.5，符合系统适用性 溶液要求。叠 氮根出 峰 时间为 24.9 min， 与其他杂质互不干扰。 图2 系统适用性溶液色谱图(1，溴离子；2，硝 酸根；3，叠 氮根) 表3叠 氮根对照品系统适用性试验结果(n =5) 峰号 保留时间(min) 峰面积 分离度 (USP) 理论塔板数 化合物 平均 RSD% 平均 RSD% 3 叠氮根 24.942 0.015 5794 1.278 1.540 15617 3.3线性 将配制的0.04、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/L校准曲线点溶液，按1.2中的分析条件进行测定，以 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，叠氮根校准曲线方程、相关系数见图3。所得校准曲 线线性关系良好，相关系数大于0.999，准确度在94.0%-104.7%之间 。 图3 叠氮根校准曲线 3.4精密度 将浓度分别为 0.04、0.20、1.00 mg/L 的低、中、高三种水平叠氮根对照品溶液进行精密度测试，分别连续 进样6次。结果显示，叠氮根保留时间 RSD 值在0.016%-0.031%之 间，峰面积 RSD 值在 0.425%-1.062%之间 ，精密度良好。 表4 重复性测 试 保留时间及峰面积RSD 值 化合物 浓度 mg/L 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 叠氮根 0.04 0.037 0.610 0.20 0.020 1.062 1.00 0.016 0.425 3.5加标回收率 对 20.0 mg/mL 厄贝沙坦供试品溶液进行分析，未检出叠氮根离子。按叠氮根离子限度的50%、100%、150%浓度分别进行回收率试验，回收率在90.7%到95.0%之间 。 图450%加标溶液色谱 图 表5 厄贝 沙 坦供试品 加 标回收率结果 化合物 加标比例 加标浓度(mg/L) 实测浓度(mg/L) 回收率% 叠氮根 50% 0.100 0.950 95.0 100% 0.200 0.189 94.5 150% 0.300 0.272 90.7 结论 采用岛津公 司 IC -16离子色谱仪，参考2020版《中国药典》建立了二维离子色谱法测定厄贝沙坦中叠氮根 含量的方法。该方法线性关系良好，相关系数 r大于0.999，精密度、准确度均符合标准，可以为厄贝沙坦中叠 氮根杂质含量测定提供参考。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心