缬沙坦原料药中六种亚硝胺类杂质检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-224Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-045 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-9030 检测缬沙坦原料药中六种亚硝胺类杂质 LCMS-QTOF-045 摘要：本文利用岛津LCMS-9030 四极杆飞行时间液质联用系统建立了缬沙坦原料药中六种亚硝胺类遗传毒性杂质NDMA、NMBA、NDEA、NDIPA、NEIPA 和 NDBA的分析方法。该方法采用外标法定量，六种亚硝胺类杂质线性相关系数均大于0.999；六种亚硝胺类化合物定量限 (LOQ) 在 0.004~0.045 ppm 之间；低中高浓度混合标准工作溶液重复性保留时间 RSD%为0.05~0.57%，峰面积RSD%为0.70~8.48%；方法回收率在82.6~107.5%之间。方法准确可靠，可用于实际样品的检测。实验结果表明，该方法能快速准确地测定缬沙坦原料药中六种亚硝胺类遗传毒性杂质。 关键词：LCMS-9030四极杆飞行时间液质联用系统 缬沙坦亚硝胺类化合物 遗传毒性杂质是指化合物本身直接或间接损伤细胞 DNA， 产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能。亚硝硝类化合物NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA 及 NDBA 是常见的遗传毒性杂质。缬沙坦是一款血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂抗高血压类药物，用于治疗高血压症、充血性心力衰竭、后心肌梗塞的药物。2018年以来，沙坦类药物中陆续被发现检出亚硝胺类化合物，引起社会的广泛关注，其将产生致癌风险，并给相关企业造成巨大损失，故需要进行严格的检测 U.S. FDA (Food & Drug Administration) 已公布沙坦类药物中亚硝胺类杂质的 LC-HRMS分析方法及相关的限度要求： 《高分辨质谱法测定 ARB(血管紧张素受体阻滞剂)原料药中六种亚硝胺类杂质》。本实验使用岛津LCMS-9030四极杆飞行时间液质联用系统，建立了缬沙坦原料药中六种亚硝胺类杂质NDMA、NMBA、NDEA、NEIPA、NDIPA和 NDBA的分析方法，供制药药检相关从业人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津LCMS-9030 四极杆飞行时间液质联用系统。具体配置为： 系统控制器： CBM-20A 柱温箱： CTO-20AC 输液泵： LC-30AD×2 检测器： SPD-M20A 自动进样器： SIL-30AC 在线脱气机： DGU-20A5 质谱仪： LCMS-9030 色谱工作站： LabSolutions Ver 5.109， LabSolutions Insight Ver 3.8 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： ACE-C18-AR (4.6 mm l.D.× 150 mm L.，3um) 流动相：A相-0.1%甲酸水；B相-0.1%甲酸甲醇 流速：0.8mL/min 柱温：40℃ 进样体积： 10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 1.50 泵 B.Conc 30 8.50 泵 B.Conc 70 13.00 泵 B.Conc 75 14.00 泵 B.Conc 98 16.00 泵 B.Conc 98 16.10 泵 B.Conc 30 20.00 控制器 Stop 质谱条件： 离子源： APCI(+，-)检测器电压：2.1kV(+，-)雾化气流速： 3L/min扫描模式： MS Scan干燥气流速：5.0L/min事件时间：0.1sDL温度：180℃阈值： Low接口温度：300℃电晕针电压：(±)3.5 kV加热模块温度：200℃EIC 提取误差：15 ppm MS参数：见表2 表2 MS 参数 No. 化合物名称 CAS 号 质谱采集时间 (min) MS Scan (+/-) MS Scan 范围(m/z) EIC 提取 (m/z) NDMA 62-75-9 2.0-4.0 + 65-85 75.0552 2 NMBA 61445-55-4 2.5-4.5 140-160 145.0623 3 NDEA 55-18-5 4.5-7.5 斗 90-110 103.0859 4 NEIPA 16339-04-1 6.5-8.5 + 105-130 117.1017 5 NDIPA 601-77-4 8.0-10.0 + 120-140 131.1175 6 NDBA 924-16-3 12.0-14.0 + 150-170 159.1490 样品前处理 对照品溶液的制备：取六种亚硝胺类化合物混合标准贮备液(10mg/L)，用甲醇作为溶剂逐级稀释为1、2、5、110、20、50、75、100 ng/mL 的标准系列工作溶液。 供试品溶液的制备：精密称取100 mg缬沙坦原料药至15mL的离心管中，加入5.0 mL甲醇超声涡旋至原料药完全溶解，即得。 结果与讨论 3.1标准工作溶液 EIC 色谱图与供试品溶液 UV 色谱图 为避免高浓度的缬沙坦原料药进入仪器，污染质谱，待六种亚硝胺化合物全部出峰后将液相流路切至废液。由于不同色谱系统的延迟体积的差异，六种亚硝胺杂质和缬沙坦的保留时间会发生变化，建议配置紫外或二极管阵列检测器进行色谱图的监控。 取2中配制得到的50 ng/mL 标准工作溶液上机分析，所得色谱图如图1(上)所示。取2中制备得到的供试品溶液上机分析，通过二极管阵列检测器(检测波长254nm)采集到的色谱图如图1(下)所示，从图中可以看出六种亚硝胺杂质与缬沙坦分离度良好。自13.5 min开始，设置分流阀流路切换至排液侧(接废液)，为避免切阀造成下一针进样的基线波动，18.0 min 将分流阀流路切换至进样侧(接入质谱))。 图1 标准工作溶液((50ng/mL) EIC色谱图(上，中)与供试品溶液 UV色谱图(下) 3.2线性范围 分别取2中配制得到的系列标准工作溶液，按照1.2的分析条件进样分析。以各目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，，以外标法绘制标准曲线，结果见表3。 图22亚硝胺类化合物标准曲线 —— 表3 标准曲线结果 No. 化合物名称 线性范围(ng/mL) 标准曲线 相关系数(r) 准确度(%) 1 NDMA 1.0-100.0 Y=2957.304X+(-2548.44) 0.9992 84.0-113.5 2 NMBA Y=665.273X+(-447.915) 0.9994 88.7-111.8 3 NDEA Y=9408.82X+(-2603.63) 0.9998 96.7-105.2 4 NEIPA Y=4800.58X+(-1195.72) 0.9991 84.1-110.0 5 NDIPA Y=6885.02X+(-2146.52) 0.9995 94.7-109.2 6 NDBA Y=13179.8X+(-2739.99) 0.9997 95.1-106.8 3.3灵敏度实验 按照1.2分析条件测定，取混合标准工作溶液中最低点1.0 ng/mL(0.05ppm)计算仪器灵敏度，色谱图见图3。通过 LabSolutions 软件计算仪器检测限及定量限，结果见表4。 图3六种亚硝胺化合物 EIC 色谱图 (1.0ng/mL) 表4六种亚硝胺化合物灵敏度测定结果 No. 化合物名称 检测限 LOD 定量限LOQ ng/mL ppm ng/mL ppm 1 NDMA 0.025 0.001 0.082 0.004 2 NMBA 0.201 0.010 0.662 0.033 3 NDEA 0.033 0.002 0.109 0.005 4 NEIPA 0.170 0.009 0.568 0.028 5 NDIPA 0.059 0.003 0.196 0.010 6 NDBA 0.039 0.002 0.129 0.006 3.4精密度 取标准工作溶液三组(浓度分别为 2.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL) 按照1.2分析条件连续进样6次，考察仪器精密度，结果如表5，六种亚硝胺化合物保留时间 RSD% 为 0.05~0.57%，峰面积RSD%为0.70~8.48%，仪器精密度良好。 参照 U.S. FDA(Food & Drug Administration) 《高分辨质谱法测定 ARB(血管紧张素受本阻滞剂)原料药中六种亚硝胺类杂质》中系统适用性的规定：重重进样6次的对照品溶液亚硝胺类杂质目标峰峰面积RSD%应不大于10%。 表5 精密度试验结果 (n=6) No. 2.0 ng/mL 10.0 ng/mL 50.0 ng/mL 化合物名称 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 RSD(%) RSD(%) RSD(%) RSD(%) RSD(%) RSD(%) 1 NDMA 0.24 6.16 0.17 4.90 0.07 1.18 2 NMBA 0.57 8.48 0.48 3.25 0.15 2.01 3 NDEA 0.07 1.26 0.10 3.41 0.09 0.88 4 NEIPA 0.10 5.08 0.09 2.46 0.08 0.70 5 NDIPA 0.07 1.18 0.09 2.37 0.07 1.11 6 NDBA 0.05 0.74 0.08 1.02 0.05 0.98 3.5加标回收率 取缬沙坦原料药样品，按2中供试品溶液的制备进行样品前处理，制备低(80%)、中(100%)、高(120%)3种浓度的溶液，每个浓度平行制备三份，上机分析，回收率测定结果见表6。三个不同浓度加标回收率在82.6~107.5%之间。 表6 加标回收实验结果(n=3) No. 化合物名称 低浓度(80%) 中浓度(100%) 高浓度(120%) 1 NDMA 92.8 101.9 86.6 2 NMBA 95.4 90.1 93.7 3 NDEA 93.8 95.8 95.8 4 NEIPA 90.3 92.6 106.2 5 NDIPA 82.6 92.3 103.6 6 NDBA 107.5 96.0 95.8 3.6样品测定 取2中配制得到的供试品溶液，按1.2中的分析条件进行测定， EIC 色谱图如图4所示，六种亚硝胺类杂质测定结果见表7。 参照 U.S. FDA (Food & Drug Administration)《高分辨质谱法测定ARB (血管紧张素受体阻滞剂)原料药中六种亚硝胺类杂质》中报告的规定：供试品中测得亚硝胺类杂质浓度 (ppm)≥LOD时，报66.“检出”；供试品中测得亚硝胺类杂质浓度 (ppm)

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