GCMSMS法测定原料药中6种亚硝胺类化合物含量

 本方法采用岛津GCMS-TQ8040 NX检测原料药中6种亚硝胺类物质，各物质在对应浓度范围内标准曲线线性良好，相关系数均在0.9995以上，仪器检出限在0.004-0.266 μg/L之间。校准曲线次低浓度点的标准品溶液连续进样6针，峰面积RSD均小于4.3 %，重复性良好。在10 ng/g加标浓度下，各物质实际样品的加标回收率为81.77 %-96.2 %。该方法简单方便，能够有效测定原料药中亚硝胺的含量。SSL-CA23-032Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-264 GCMSMS 法测定原料药中6种亚硝胺类化 合物含量 GCMSMS-264 摘要：本文利用岛津 GCMS-TQ8040 NX三重四极杆气质联用仪，建立 了 一种原料药中6种亚硝胺类化合物 的 测 定方法。在0.05-20 ug/L 浓度范围内各组分线性关系良好，各组分相关系数均达到 0.9995 以上，仪器检 出限在 0.004-0.266 ug/L之间。校准曲线次 低 浓度点标准品溶液连续进样6针，峰面积 RSD 均小于4.3%。实际样 品 在 10 ng/g的加标浓度下，各物质的加标回收率为 81.77 %-96.2%。该方法简单方便，能够有效的 监测原料药中6种亚硝胺类物质的含量。 关键词：三重四极杆气质联用仪 原料药 基因毒性杂质 亚 硝胺 技术特点： *样品经溶剂提取离心过膜后上机分析，前处理简单方便。 必6种 亚硝胺类物质在 WAX 色谱柱上分离良好，灵敏度高。 药品原料药和制剂的生产过程中 ，不可避免地会产 生 或引入影响药物稳定性甚至威胁人类健康的杂质，比 如在血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、雷尼替丁及其他药 物中发现潜在致癌物-亚硝胺杂质。 亚硝胺类物质在几种动物中是高效基因毒性杂质，NDMA 和 NDEA 被世界卫 生 组织(WHO) 国际癌症研究 机构判定为2A类致癌物， ICH M7(R1)指南中明确指 出该类物质具有较高致癌性(“关注队列”)，属于高 诱变致癌物。FDA 建议的亚硝胺杂质 NDMA， NDEA， 实验部分 NMBA， NMPA， NIPEA 和 NDIPA的可接受摄入量(AI 限值) NDMA、NMBA 为 96ng/天， NDEA、NMPA、NIPEA、NDIPA 为 26.5 ng/天。因此，非常有必要对药 品 中的亚硝胺类物质进行监测，从而保证药品的安全。 本文采用二氯甲烷溶液对原料药进行提取，结合 MRM采集方法，建立了一种快速、准确分析原料药中6种 亚 硝胺类物质 的 检测方法，该方法 简 单方便、检出限 低、重现性好，可以为原料药中亚硝胺类物质的检测提 供参考。 1.1仪器 GCMS-TQ8040 NX 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪 1.2分析条件 色 谱 柱 VF-WAX MS(30 m×0.25 mm×1um) 柱温程序： 40℃ (0.5 min)_20℃ /min_200℃_60℃/min_250℃ (3 min) 进样口温度： 240°℃ 方 式：E 源 流速控制方式：恒线速度方式 离 离温 度： 230℃ 线 速 度 ： 36.1 mL/min 色谱质谱接口温度 ： 250℃ 进样方式：不分流进样 检 测 器 电压 调谐电压+0.7 kV 进 样 量 量： 1uL 采 集 模 式 ： MRM，离 子 信息见表1 样品前处理 准确称取0.5g药品至15mL离心管中，加入5 mL二氯甲烷溶液，涡旋1 min 后， 4000 r/min 离心5min， 取上清液经 0.22 um 有机滤膜过滤后 ， GC-MS/MS 分析。 ■结果与讨论 3.16种亚硝胺标准溶液谱图 图16种亚硝胺标准溶 液 色谱图(20 ug/L) 5.29e 3 Ｑ102.00>85.10(+) 1.73e3Q 116.00>99.10(+) 图26种亚硝胺标准品溶液质量色谱图(0.1-1ug/L) 表1166种 亚硝胺各组分信息 No. 组分名称 简称 CAS 号 保留时间 定量离子对 CE(V) 定性离子对 CE(V) 1 N-二甲基亚硝胺 NDMA 62-75-9 7.62 74.00>44.10 6 74.00>42.1074.00>59.00 2118 2 N-亚硝基二乙胺 NDEA 55-18-5 8.23 102.00>85.10 6 102.00>44.10102.00>56.10 1515 3 N-亚硝基异丙基乙胺 NIPEA 16339-04-1 8.49 116.00>99.10 6 71.00>56.10116.00>70.10 618 4 N-亚硝二异丙胺 NDIPA 601-77-4 8.67 130.00>88.10 6 130.00>113.10130.00>42.10 39 5 N-亚硝基二丁胺 NDBA 924-16-3 10.10 116.00>99.10 6 158.00>141.20116.00>74.10 69 6 N-甲基-N-亚硝基苯胺 NMPA 614-00-6 10.18 106.00>77.10 18 106.00>79.10107.00>77.10 927 3.2标准曲线和检出限 分别配制不同浓 度的 亚硝胺混合标准溶液，取1uL进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，各化合物标准 曲 线如图3所示。根据线性最低点标样数据，以3倍信噪比(峰至峰)计算6种亚硝胺仪器检出限，各化合物校准曲线梯度、检 出 限以及线性相关系数如表2所示。 图3 6种亚硝胺 标 准曲线 表22各组分 校 准 曲线相关系数及检 出 限 NO. 组分名称 浓度范围 (ug/L) 相关系数(R) 检出限(ug/L) 1 NDMA 0.25、0.5、2.5、5、10 0.9999 0.035 2 NDEA 0.05、0.1、0.5、1、2 0.9997 0.004 3 NIPEA 0.1、0.5、1、2、5 0.9999 0.009 4 NDIPA 0.1、0.5、1、2、5 0.9995 0.008 5 NDBA 1、2、5、10、20 0.9998 0.266 6 NMPA 0.1、0.5、1、2、5 0.9994 0.049 3.3重复性实验 取次低浓度点标准品溶液，连续进样6次，考 察仪器的重 复 性，测定结果见表3。 表336种亚硝胺类物质重复 性 结果 No. 组分名称 峰面积 RSD(%) 1 2 3 4 5 6 1 NDMA 29938 29943 29600 29451 29835 30535 1.25 2 NDEA 5487 5372 5208 5256 5549 5582 2.87 3 NIPEA 3190 3289 3281 3032 3356 3309 3.60 4 NDIPA 4620 4613 5050 4579 4641 4794 3.81 5 NDBA 91491 91387 93196 92226 91924 96159 1.94 6 NMPA 10514 11478 10818 10710 11723 10904 4.27 3.4加标回收率 准确称取某实际原料药样品 0.5 g， 添加6种亚硝胺混标，加标浓 度 为 10 ng/g， 平 行处理3份，样 品测定 结果以及加标回收率结果见表4。 图 4 实际 原料 药 样品谱图 表4 各 组 分添加回收率结果 No. 化合物名称 加标样品含量(ng/g) 平均回收率 (%) 样品含量 (ng/g) 1 2 3 NDMA N.D 10.9 7.49 10.4 96.2 2 NDEA N.D 8.20 8.29 8.74 84.1 3 NIPEA N.D 8.04 8.11 8.37 81.7 4 NDIPA N.D 8.27 8.43 9.41 87.0 5 NDBA N.D 9.56 8.53 8.95 90.1 6 NMPA N.D 9.00 7.66 10.9 91.7 注： N.D表示未检出。 ■结论 本方法采用岛津 GCMS-TQ8040 NX 检测原料药中6种亚硝胺类物质，各物质在对应浓度范围内标准曲线线 性良好，相关系数均在0.9995以上，仪器检出限在 0.004-0.266 ug/l之间。校准曲线次低浓 度 点的标准品溶液 连续进样6针，峰面积 RSD 均小于4.3%，重 复性良好。在10 ng/g加标浓度下，各物质实际样品的加标回收 率为 81.77%-96.2%。该方法简单方便，能够有效测定原料药中亚硝胺的含量。 岛津应用云