双抗及其碎片中异质性检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-586Excellence in Science Excellence in ScienceLC-245 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 生物兼容液相在双抗样品分析中的应用 LC-245 摘要：本文利用岛津生物兼容液相色谱系统 (Nexera Bio) 和尺寸排阻色谱技术(SEC)，建立了双抗样品的大小异质性分析方法。色谱峰分离度良好，重复性实验结果显示，其保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.2%和2%，表明重复性良好，方法稳定可靠。 关键词：生物兼容液相系统双特异性抗体尺寸排阻色谱 双特异性抗体(以下简称双抗)是同时能够结合两个不同表位或者抗原的抗体，从而阻断或激活双靶点信号通路，介导免疫细胞对肿瘤细胞更好的杀伤，因此可能会获得比单一抗体更好的临床结果，双抗研发也备受关注。 双抗种类繁多，有基于片段化设计的分子，直接将多个抗原结合单元结合在一个没有 Fc区域的分子上，设计简单，但缺乏Fc端，血浆半衰期相对较短，可能存在稳定性和聚集性问题；也有基于保留 Fc区域设计的对称性分子设计和非对称性分子设计模式，保留Fc区域的双抗药物，血浆半衰期较长，可发挥类似于 IgG的抗体特点。目前已有超过150多个双抗产品处于临床试验阶段，国内众多生物制药公司也已形成独特专 实验部分 利技术的双抗构建平台，为双抗产品研发助力。 在双抗产品研发生产过程中，需要对其大小异质性行分析，反映双抗连接情况，保障产品质量，非片段化设计的双抗分子量较大，故通常采用尺寸排阻色谱法(SEC) 进行其大小异质性分析。 本文采用岛津生物兼容液相色谱系统，针对不同尺寸色谱柱在其最佳流速下配置了不同尺寸检测器流通池，以获得优异的分离度和峰形。避免因流通池尺寸不合适而产生峰形扩散导致分离度不佳的现象。依据上述原理，特建立了双抗样品(Fc 端融合型对称分子)大小异质性相关分析检测方法(方法一和方法二)，供相关检测人员参考。 1.3样品前处理方法 双抗样品用水溶解后直接进样，浓度为 5.0 mg/mL 结果与讨论 2.1分离度实验(方法一) 本方法使用 SHIMEN Ankylo SEC-300， 300 mm x 4.6 mm l.D.， 3 um色谱柱，最佳流速为 0.21 mL/min，因此该方法采用了半微量流通池，避免在低流速下使用标准流通池而产生峰扩散导致分离度不佳的现象。色谱峰出峰情况如图1所示。从图中可见：双抗样品共出现4个主要色谱峰，该双抗样品为单抗 Fc 端融合型，根据尺寸排阻色谱出峰顺序，4个主要色谱峰分为双抗，单抗(未能融合)， ScFv (单链抗体)以及碎片。各个色谱峰峰形良好，且分离度都大于1.5，表明分离良好。分离度结果如下表1所示。 图1 双抗样品分离色谱图 表1 分离度测试 名称 峰1 峰2 峰3 峰4 分离度 - 2.1 4.1 1.7 拖尾因子 1.2 1.1 1.2 1.2 2.2重复性实验(方法一) 连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下表2所示。标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.2%和2%，表明仪器精密度良好。 表2 重复性测试(n=6) 名称 峰1 峰2 峰3 峰4 R.T. Area R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 11.706 778，116 12.704 893，651 14.534 346，457 15.370 95，228 2 11.696 776，020 12.695 891，509 14.525 346，685 15.366 95，219 3 11.706 775，261 12.704 891，355 14.533 346，600 15.368 94，472 4 11.701 774，890 12.700 890，889 14.530 347，083 15.367 93，582 5 11.704 774，528 12.702 892，158 14.530 347，296 15.366 94，719 6 11.698 775，728 12.696 893，139 14.524 347，804 15.358 94，784 AVG 11.702 775，757 12.700 892，117 14.529 346，988 15.366 94，667 RSD/% 0.03 0.16 0.03 0.12 0.02 0.14 0.02 0.64 2.3分离度实验-(方法二) 色谱峰出峰情况如图2所示。各个色谱峰峰形良好，且分离度都大于1.5，表明分离良好。分离度结果如下表3所示。 图2 双抗样品分离色谱图 表3 分离度测试 名称 峰1 峰2 峰3 峰4 分离度 一 2.1 4.1 1.6 拖尾因子 1.1 1.1 1.2 1.2 2.4重复性实验(方法二) 重复性结果如下表4所示。标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别小于0.2%和2%，表明仪器精密度良好。 表4 重复性测试(n=6) 名称 峰1 峰2 峰3 峰4 R.T. Area R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 10.177 459，185 11.048 542，096 12.649 213，568 13.395 56，016 2 10.176 456，608 11.046 539，709 12.645 213，905 13.389 55，562 3 10.171 455，557 11.042 538，900 12.640 214，305 13.384 55，469 4 10.149 452，306 11.019 537，355 12.615 213，434 13.356 54，606 5 10.146 453，633 11.014 538，792 12.609 213，830 13.348 54，663 6 10.150 453，658 11.020 539，249 12.615 213，602 13.357 54，525 AVG 10.161 455，158 11.032 539，350 12.629 213，774 13.372 55，140 RSD/% 0.14 0.54 0.14 0.28 0.13 0.14 0.14 1.13 以上结果显示两种方法的分离度和重复性结果良好，表明不同内径尺寸的色谱柱要实实柱效最大化，得到较好的峰形和分离度，需要在其最佳流速下配置合适的紫外检测器流通池，经过优化“方法一”中4.6mm内径的色谱柱最佳流速为 0.21mL/min， 此时需要配置半微量流通池(池体积2.5uL，货号 S228-45605-41)，如果配置大体积的流通池，样品会在流通池内发生扩散现象，导致峰形变宽，进而使得分离度降低。而对于8.0mm内径的色谱柱，在0.7 mL/min 的流速下配置标准流通池(池体积12uL，货号 S228-37440-44))可以得到最佳峰形和分离度。 结论 本实验建立了一种使用岛津生物兼容液相系统 (Nexera Bio) 结合 SHIMEN Ankylo SEC-300 色谱柱进行双抗样品大小异质性分析的方法。选择不同规格色谱柱，需要配套不同的流通池，以获得优异的分离度和峰形。结果显示，在配套合适的流通池后，两款色谱柱，4个主要色谱峰拖尾因子均小于1.2，峰形良好，且分离度都大于1.5，表明色谱分离良好；双抗样品溶液重复进样6针，其保留时间和峰面积的RSD% 分别为小于0.2%和小于2%，表明重复性良好，方法稳定可靠。建立的方法可应用于双抗样品大小异质性的测试。 岛津应用云 本实验建立了一种使用岛津生物兼容液相系统（Nexera Bio）结合SHIMEN Ankylo SEC-300色谱柱进行双抗样品大小异质性分析的方法。选择不同规格色谱柱，需要配套不同的流通池，以获得优异的分离度和峰形。结果显示，在配套合适的流通池后，两款色谱柱，4个主要色谱峰拖尾因子均小于1.2，峰形良好，且分离度都大于1.5，表明色谱分离良好；双抗样品溶液重复进样6针，其保留时间和峰面积的RSD%分别为小于0.2%和小于2%, 表明重复性良好，方法稳定可靠。建立的方法可应用于双抗样品大小异质性的测试。