缬沙坦中亚硝胺类检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-477Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-541 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 颉定缬沙坦中5种亚硝胺类基因毒性杂质 LCMSMS-541 摘要：本文参考EP征求意见《2.4.36.N-NITROSAMINES IN ACTIVE SUBSTANCES(活性物质中的N-亚硝胺)》，使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8045 检测了缬沙坦中的NDMA、NMBA、NDEA、NDiPA 和 NEiPA 这5种亚硝胺类基因毒性杂质。该方法采用内标法定量，五种亚硝胺类杂质线性相关系数均在 0.9981以上；0.9ng/mL五种亚硝胺类化合物定量离子对 S/N 在11.2-48.5之间，定性离子对 S/N 均在6.7以上；不同浓度标准溶液连续进样6次，其保留时间和峰面积的相对标准偏差分别不超过 0.19%和12.66%；缬沙坦原料药三个不同浓度样品加标回收率在 73.1~113.1%之间。 关键词： LCMS-8045缬沙坦亚硝胺基因毒性杂质EP 亚硝胺类物质属于最近较受大家关注的基因毒性杂质之一，包括NDMA、NMBA、NDEA、NDiPA、NEiPA、NDPA、NDBA等。国家药品监督管理局药品评审中心2020年5月发布的《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)》中指出：“亚硝胺类杂质属于 ICH M7(R1)(《评估和控制药物中 DNA 反应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险》)指南中提及的“关注队列”物质。因此药物中由原料、制药工艺、包装 材料等引入和产生的氮亚硝胺类杂质的检测对于药物安全性控制具有重要意义。 本文参照EP征求意见《2.4.36.N-NITROSAMINESIN ACTIVE SUBSTANCES(活性物质中的N-亚硝胺)》，使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045 检测了缬沙坦中的 NDMA、NMBA、NDEA、NDiPA 和 NEiPA 这5种亚硝胺类基因毒性杂质。 系统控制器： CBM-40自动进样器：SIL-40C X3输液泵： LC-40B X3质谱仪： LCMS-8045柱主箱： CTO-40SPDA检测器：SPD-M40 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 SP2 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： ACE Excel3 C18-AR， 150 mm×4.6 mm l.D.，3 um 流动相：A-0.1%甲酸水溶液；B-甲醇 流速：0.50mL/min 柱温：40℃ 进样量：20uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20% 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 20 6.00 Pumps Pump B Conc. 45 14.00 Pumps Pump B Conc. 45 16.00 Pumps Pump B Conc. 95 35.00 Pumps Pump B Conc. 95 35.01 Pumps Pump B Conc. 20 43.00 Controller Stop 注：17-35 min 洗脱液切入废液 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8045 离子源： APCI* 接口电压：4.5kV 接口温度：350℃ 加热模块温度：200℃ DL温度：180℃ 雾化气流速：4.4 L/min 干燥气流速：10.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 No. 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE Q3 Pre Bias(V) QA Bias (V) QARF (V) 75.00 57.80* -13.0 -18.0 -21.0 50 100 1 NDMA 43.00 -29.0 -18.0 -15.0 50 100 147.20 117.10* -11.0 -9.0 -22.0 0 50 2 NMBA 87.10 -11.0 -13.0 -16.0 0 50 103.10 75.00* -16.0 -13.0 -26.0 0 50 3 NDEA 47.00 -11.0 -18.0 -16.0 0 50 NEiPA 117.10 75.10* -25.0 -12.0 -29.0 0 50 4 46.90 -14.0 -18.0 -17.0 0 50 NDiPA 131.10 88.90* -10.0 -12.0 -15.0 0 50 5 47.10 -10.0 -15.0 -17.0 0 50 6 NDPA 131.10 89.10* -10.0 -10.0 -17.0 0 50 47.00 -10.0 -14.0 -16.0 0 50 7 NDBA 159.30 57.10* -12.0 -14.0 -20.0 0 50 103.10 -12.0 -12.0 -20.0 0 50 8 NDEA-d10 113.10 81.10* -12.0 -15.0 -15.0 0 50 34.10 -12.0 -16.0 -30.0 0 50 *定量离子对 1.3样品前处理 精确称取 150 mg 缬沙坦于10mL离心管中，加入0.5 mL甲醇和 0.5 mL 内标溶液(9 ng/mL于甲醇中)，涡旋 5 min 后超声提取 15 min；加入4.0 mL水，再次涡旋 5 min 后超声提取15 min， 10000 r/min 离心 5 min。以0.2 um GHP 滤膜过滤后，滤液上机检测。 结果讨论 2.1标准品 TIC图和缬沙坦PDA色谱图(254nm) 为避免高浓度的缬沙坦原料药进入仪器污染质谱，EP征求意见稿2.4.36建议在 NDiPA出峰后将洗脱液切入废液流路，本实验最终确定 17.5-35 min之间洗脱液切入废液流路。由图1可知，NDMA、NMBA、NDEA、NEiPA 和 NDiPA与缬沙坦分离良好。NDPA、NDBA 与缬沙坦保留时间接近，意见稿建议使用 GC-MS/MS 方法检测。 图1199 ng/mL 混标TIC图(上)和缬沙坦 PDA 色谱图 (254nm) 2.2专属性 20%甲醇水溶液和0.9 ng/mL 的标准溶液 MRM 色谱图如图2所示，空白样品无干扰。 图2 20%甲醇(绿)和0.9 ng/mL标准溶液(蓝)i)MRM色谱图 2.3灵敏度 EP征求意见见2.4.36中规定：浓度为0.9 ng/mL的各目标物定量离子对和定性离子对 S/N 应分别大于10和3。其MRM 色谱图及 S/N分别如图3和表3所示，灵敏度满足相关要求。 图 3 0.9 ng/mL 标准溶液定量离子对(蓝)和定性离子对(黑)MRM色谱图 表3 定量离子对和定性离子对 S/N(0.9 ng/mL) No. 化合物 前体离子 产物离子 S/N(ASTM 法) 1 NDMA 75.00 57.80* 11.2 43.00 17.5 2 NMBA 147.20 117.10* 26.6 87.10 6.7 3 NDEA 103.10 75.00* 13.5 47.00 8.3 4 NEiPA 117.10 75.10* 47.5 46.90 28.3 5 NDiPA 131.10 88.90* 22.0 47.10 20.7 6 NDPA 131.10 89.10* 28.4 47.00 18.1 7 NDBA 159.30 57.10* 21.2 103.10 27.5 2.4校准曲线 以20%甲醇水溶液为溶剂，逐级稀释配制浓度分别为0.9、1.84.5、9、18、45 ng/mL的混合标准溶液，内标法建立校准曲线如图4所示，线性方程、相关系数及准确度如表4所示。 Area Ratio Area Ratio Area Ratio 17.5-NMBA 0 20 40 Conc.Ratio (ng/mL) 图4 校准曲线 表4 较准曲线参数 目标物 线性范围 线性方程 相关系数 准确度 (ng/mL) (%) NDMA 0.9-45 Y=(0.1642)X+(0.0007) 0.9985 90.2-108.5% NMBA 0.9-45 Y=(5078.02)X-(0.0645) 0.9983 88.3-112.2% NDEA 0.9-45 Y=(0.3191)X-(0.0601) 0.9992 89.5-110.4% NEiPA 0.9-45 Y=(1.6089)X+(0.0383) 0.9987 89.2-110.6% NDiPA 0.9-45 Y=(0.4748)X+(0.0431) 0.9981 89.1-110.5% NDBA 0.9-45 Y=(0.7153)X+(0.4456) 0.9959 89.8-110.7% NDPA 0.9-45 Y=(0.4703)X-(0.0167) 0.9946 93.6-106.6% 2.5重复性考察 对不同浓度的样品分别连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD. 结果见表5，保留时间 RSD 均不高于0.19%，峰面积RSD 均不高于12.66%. 表5保留时间和面积 RSD 名称 浓度(ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD (%) 0.9 0.12 10.08 NDMA 1.8 0.07 4.28 4.5 0.09 4.53 0.9 0.19 10.19 NMBA 1.8 0.11 9.50 4.5 0.12 6.10 0.9 0.16 12.66 NDEA 1.8 0.04 7.70 4.5 0.08 10.27 0.9 0.17 6.41 NEiPA 1.8 0.04 4.09 4.5 0.10 4.20 0.9 0.19 5.18 NDiPA 1.8 0.09 5.62 4.5 0.16 5.65 2.5实际样品分析及回收率考察 缬沙坦中加标不同浓度，考察回收率，结果如表6所示。 表6 实际样品分析及加标回收率考察 名称 缬沙坦进样 加标回收率(%) 溶液浓度 0.9 ng/mL 1.8ng/mL 4.5 ng/mL NDMA <0.9 ng/mL 101.7 100.8 96.2 NMBA N.D. 111.8 100.8 109.9 NDEA N.D. 113.1 112.4 106.6 NEiPA N.D. 86.0 81.4 84.1 NDiPA N.D. 73.1 77.2 74.9 注：N.D.表示未检出 结论 本文参考EP征求意见《2.4.36.N-NITROSAMINES IN ACTIVE SUBSTANCES(活性物质中的N-亚硝胺)》，使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045 检测了缬沙坦中的 NDMA、NMBA、NDEA、NDiPA和 NEiPA 这5种亚硝胺类基因毒性杂质。该方法采用内标法定量，五种亚硝胺类杂质线性相关系数均在0.9981以上；0.9ng/mL五种亚硝胺类化合物定量离子对 S/N 在11.2-48.5之间，定性离子对 S/N 均在6.7以上；不同浓度标准溶液连续进样6次，其保留时间和峰面积的相对标准偏差分别不超过 0.19%和12.66%；缬沙坦原料药三个不同浓度样品加标回收率在73.1~113.1% 之间。 岛津应用云 参考EP征求意见《2.4.36.   N-NITROSAMINES IN ACTIVE   SUBSTANCES(活性物质中的N-亚硝胺)》，使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8045检测了缬沙坦中的NDMA、NMBA、NDEA、NDiPA和NEiPA这5种亚硝胺类基因毒性杂质。该方法采用内标法定量，五种亚硝胺类杂质线性相关系数均在0.9981以上；0.9   ng/mL五种亚硝胺类化合物定量离子对S/N在11.2-48.5之间，定性离子对S/N均在6.7以上；不同浓度标准溶液连续进样6次，其保留时间和峰面积的相对标准偏差分别不超过0.19%和12.66%；缬沙坦原料药三个不同浓度样品加标回收率在73.1~113.1%之间。