英夫利昔单抗中肽图分析检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-261Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-023 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel： 86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 利用 LCMS-9030 进行英夫利昔单抗药物肽图分析 LCMS-QTOF-023 摘要：本文采用岛津 LCMS-9030 高分辨Q-TOF 液质联用仪对英夫利昔单抗进行肽图分析，并结合岛津LabSolutions 和 Protein Metrics 软件对肽图分析结果进行解析。结果显示在只应用胰蛋白酶的情况下，轻链和重链的序列覆盖率分别为93.46%和92.0%。利用 Protein metrics 软件对肽段上的修饰基团进行解析，结果显示该单抗的修饰类型主要有脱酰胺 (Deamidated)、糖基化 (NGlycan)、氧化 (Oxidation)、氨甲酰化 (Carbamyl) 等，大部分修饰肽段的比例在0.5%以下。 英夫利昔单抗 (Infliximab) 是1998年美国食品药物管理局(FDA)批准的第一个生物治疗药物。其机制包括拮抗肿瘤坏死因子(TNF-a)活性，对免疫细胞的直接细胞毒性和诱导T细胞凋亡。作为批准用于人治疗的第一个单克隆TNF抗体，英夫利昔单抗是纯化的重组 DNA 衍生嵌合人-小鼠IgG单克隆抗体，并且含有鼠重链和轻链可变区，连接到人基因组重链和轻链恒定区。 英夫利昔单抗可以迅速与人类可溶性或膜形式的TNF 形成稳定的复合物，并终止 TNF的生物活性以及 信号。1998年被 FDA 批准后，英夫利昔单抗用于炎症性肠病(IBD)治疗约18年，其临床疗效已得到很好的研究。 在单抗药物的生产过程中的质量控制环节，为了更好控制单抗药物的质量，需要将单抗酶解成肽段，在肽段水平评估单抗中出现的各种修饰，例如氧化、脱酰胺、酰胺化、异构化等。本文采用岛津LCMS-9030 Q-TOF四极杆-飞行时间液质联用仪对英夫利昔单抗酶解后肽段进行分析，并结合岛津 LabSolutions和 Protein Metrics 软件对检测结果进行解析。 1.1仪器 本实验使用 LCMS-9030 Q-TOF 系统。具体配置为 LC-30AD 输液泵，DGU-20As在线脱气机， SIL-30AC自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A lite 系统控制器， LCMS-9030 Q-TOF质谱仪， LabSolutions Ver. 5.96色谱工作站， Protein Metrics 数据处理软件 (PMi公司)。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 2.1 mm l.D.× 100 mm L.，1.9 um (P/N：227-30048-02， SGLC) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.4mL/min 柱温：60℃ 进样体体：10 uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 50.00 Pump B.Conc 40 51.00 Pump B.Conc 90 56.00 Pump B.Conc 90 56.10 Pump B.Conc 5 60.00 Controller Stop 质谱条件 1.3样品前处理 利用超纯水将英夫利昔单抗粉末制剂配制成 1.0 mg/mL的溶液，然后吸取 10 pL该溶液样品，加入80pL还原溶液(50mM Tris-HCI，含8M尿素和5mM DTT)，在37℃下震摇60 min，结束后加入4 uLIAA溶液(500mM)，在室温条件下避光震摇30 min， 然后加入600 uL酶解缓冲液(50 mMTris-HCI)和5uL胰蛋白酶溶液(含1 ug胰蛋白酶)，在37℃下反应6小时，酶解结束后加入10 uL 50%甲酸水溶液终止酶解反应。 结果与讨论 2.1英夫利昔单抗肽段色谱图 图1英夫利昔单抗酶解后的总离子流色谱图 2.2数据处理 将 LabSolutions 采集好的数据直接导入到 Protein Metrics 软件的PMi-PTM模块，并导入英夫利昔单抗的氨基酸序列，进行蛋白序列覆盖率的计算和蛋白修饰基团分析。在仅使用胰蛋白酶的条件下，由图2可知英夫利昔单抗重链的序列覆盖率为92.00%，轻链覆盖率为93.46%(表2和图2)。通过该软件 PMi-PTM 模块不仅查看个肽段的一级质谱图，还可以根据二级质谱图校对肽段的碎片，尤其是带修饰的碎片基团，，以肽段DSTYSLSSTLTLSK为例，可以根据二级质谱图清晰判断每个碎片的断裂位置(图3)。 表2酶解肽段序列覆盖结果 蛋白名称 覆盖的氨基酸个数/总氨基酸个数 序列覆盖率% 英夫利昔单抗轻链 200/214 93.46 英夫利昔单抗重链 92.00 LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 图2英夫利昔单抗酶解后序列覆盖图 图3肽段 DSTYSLSSTLTLSK的色谱图和质谱图 经软件分析发现该英夫利昔单抗上存在的修饰有脱酰胺 (deamidated)、糖基化 (NGlycan)、、氧化(Oxidation) 、氨甲匕化 (Carbamyl)等，大部分修饰所占比例在0.5%以下(表3)。以脱酰胺 (deamidated)修饰为例，肽段 VVSVLTVLHQDWLNGK 发生修饰后，修饰后的肽段保留时间比未修饰的肽段要长，且质谱图上也可看出明显差异，未修饰肽段 m/z 603.341(带3个电荷)，修饰后肽段 m/z 603.670(带3个电荷)(图4)。 表3英夫利昔单抗酶解后各肽段上检测到的修饰以及修饰肽段占比 蛋白名称 肽段名称 修饰类型 修饰氨基酸 修饰位点 修饰比例 重链 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK Deamidated/0.9840 199 0.38 重链 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK Deamidated/0.9840 N 211 1.25 重链 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK Deamidated/0.9840 Q 199 1.25 重链 EEQYNSTYR NGlycan/1241.4545 N 300 0.05 重链 GLEWVAEIR Carbamyl/43.0058 NTerm 43 0.07 重链 GPSVFPLAPSSK Carbamyl/43.0058 NTerm 124 0.09 重链 LSCVASGFIFSNHWMNWVR Deamidated/0.9840 N 31 0.13 重链 LSCVASGFIFSNHWMNWVR Oxidation/15.9949 W 33 0.11 重链 SAVYLQMTDLR Deamidated/0.9840 Q 84 0.48 重链 VVSVLTVLHQDWLNGK Deamidated/0.9840 N 318 0.17 重链 VSVLTVLHQDWLNGK Deamidated/0.9840 Q 314 0.53 重链 VSVLTVLHQDWLNGKEYK Deamidated/0.9840 N 318 1.14 重链 WSVLTVLHQDWLNGKEYK Deamidated/0.9840 314 0.38 重链 FSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQ SHSWPFTFGSGTNLEVK Deamidated/0.9840 N 76 0.4 轻链 FSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQ SHSWPFTFGSGTNLEVK Deamidated/0.9840 Q 89 0.4 轻链 FSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQ SHSWPFTFGSGTNLEVKR Deamidated/0.9840 Q 89 0.22 图4 肽段VVSVLTVLHQDWLNGK修饰及未修饰肽段的色谱图和质谱图 结论 本文采用岛津 LCMS-9030 Q-TOF 液质联用仪对英夫利昔单抗样品进行肽图分析，并结合LabSolutions和 Protein Metrics 软件对肽图分析结果进行解析。结果显示在只应用胰蛋白酶的情况下，轻链和重链的序列覆盖率分别为93.46%和92.00%。经Protein metrics 软件对肽段上的修饰基团进行解析，结果显示该单抗样品上的修饰类型有脱酰胺 (deamidated)、糖基化(NGlycan)、氧化 (Oxidation) 、氨甲酰化 (Carbamyl)等，大部分修饰类型所占比例在0.5%以下。 岛津应用云 本文采用岛津LCMS-9030 Q-TOF液质联用仪对英夫利昔单抗样品进行肽图分析，并结合LabSolutions和Protein Metrics软件对肽图分析结果进行解析。结果显示在只应用胰蛋白酶的情况下，轻链和重链的序列覆盖率分别为93.46%和92.00%。经Protein metrics软件对肽段上的修饰基团进行解析，结果显示该单抗样品上的修饰类型有脱酰胺（deamidated）、糖基化（NGlycan）、氧化（Oxidation）、氨甲酰化（Carbamyl）等，大部分修饰类型所占比例在0.5%以下。