头孢替唑钠及其杂质中杂质定性分析检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-844Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-001 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用定性检测头孢替唑钠及其杂质 LCMS-QTOF-001 摘要：本文利用岛津液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Q-TOF) 对抗生素药物头孢替唑钠杂质进行定性分析。通过 一级高分辨质谱信息获得准确分子量并用 formula predictor 预测分子式，结合紫外吸收光谱图推测化合物大致发色 基团和可能的不饱和度，将该信息用于分子式的进一步筛选。结合头孢替唑钠[M+H]*峰与杂质[M+H]*峰的差异，以及二级碎片信息，推测可能的杂质结构。将该结构导入 ACD/Labs 软件，所得碎片与二级质谱匹配，最终筛选得到可能的杂质结构。 关键词：液相色谱-四极杆飞行时间质谱 Q-TOF 头孢替唑钠 Ceftezole Sodium 药物的质量研究过程中，常常需要对未知杂质进行定性分析，常用的鉴定方法为高分辨质谱一级和二级信息。根据 ICHQ3A要求，当原料药最大日剂量大于2g/天，杂质的鉴定定值为0.05%；当原料药最大日剂量小于等于2g/天，则该杂质的鉴定阈值为0.1%。头孢替唑钠 (Ceftezole Sodium))，化学名为6R(反式)-8-氧代-7-[(1H-1-四氮唑基乙酰基)胺基]-3-[[2-(1，3，4-噻二唑基)硫]甲基]-5-硫杂-1-氮杂二环[4，2，0]辛-2-烯-2- 1.材料与方法 羧酸钠盐，化学式C13H1NgNaO4S3， MW 462.4528， 是由日本藤泽药品公司合成和开发的半合成头孢菌素抗生素，于1978年4月以Ceolslin 的商品名上市销售。由于该药物上市较晚、研究较少，但由于其显著的临床作用，生产厂家逐年增加。本文以头孢替唑钠为样品，介绍岛津Q-TOF LCMS-9030 在药物杂质鉴定中应用及相关流程。 试剂：MS级乙腈、甲酸，水为超纯水机制备所得。 样品：注射用头孢替唑钠 仪器：快速液相色谱仪 Nexera 系统、四极杆飞行时间质谱仪 LCMS-9030。 Nexera 系统包括 LC-30AD×2(输液泵)， DGU-20As(在线脱气机)， SIL-20ACXR(自动进样器)， CTO-20AC (柱温箱)， SPD-M20A(二极管阵列检测器)， CBM-20A (系统控制器)。数据采集和分析由 LabSolutions Ver5.95(工作站)完成。质谱碎片结构分析由 ACD/Labs Ver2012完成。 1.2样品信息 称取1mg样品，用1mL超纯水溶解，振摇，得到浓度为1mg/mL样品溶液，0.22 um聚四氟乙烯滤膜过滤后进样分析。 1.3分析条件 液相条件： 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%柱温：45℃检测波长：254nm甲酸乙腈流速：0.3mL/min进样体积：2uL洗脱方式：等度洗脱， 色谱柱： Shim-pack XR-ODS III 2.0 mml.D.×150 mm L.， 2.2 um 质谱条件： 离子源： ESI(+) DL 管温度：250C 接口电压：4.5kV 雾化气：3.0L/min 加热气流量：10.0 L/min 干燥气流量：10.0 L/min 加热块温度：400℃校准方法：外标法校准质量数一级质谱质量范围： m/z 250-500二级及谱质量范围：m/z 100-500CE：35±17V 接口温度：300℃ 结果与讨论 头孢替唑的 LC-UV图中(图1)，峰面积在0.05%-0.6%的杂质共5个(杂质1-5)，这5个化合物中，杂质1，3，4和5具有较好的ESI+响应，可获得一级和二级质谱图。杂质2在ESI+和ESI-响均均较弱，需要其他手段鉴定。杂质6含量较低，可通过增加进样量，并选择仅杂质6进入质谱的方式获得完整的一级和二级质谱信息。从[M+H]*峰数值和 formula predictor 推测得分子式可以看到，杂质1和6，杂质3和4为两对同分异构体。杂质1-6一级质谱信息如表1所示(杂质2未鉴定)。主成分头孢替唑紫外吸收光谱图和裂解规律如图2所示。 图1头孢替唑钠LC-UV图(左)和LC-MS图(右) 2.1主成分结构信息 根据头孢替唑的一级质谱图获得[M+H]*峰信息为441.02099， formula predictor 预测得到分子式C13H12Ng04S3。根据头孢替唑的二级质谱碎片信息，结合ACD/Labs 软件，推得其质谱裂解规律如图2所示。 图2头孢替唑谱图信息(上)和可能的裂解规律(下) 表1样品中杂质的分子式预测结果 名称 Formula (M) lon Meas. m/z Pred.m/z Diff (ppm) Iso Score 杂质1 C11H10N6O4S [M+H]+ 323.05539 323.05570 -0.9721 94.57 杂质3 C13H12N：O5S3 [M+H]+ 457.01650 457.01654 -0.1207 99.16 杂质4 C13H12N8O5S3 [M+H]+ 457.01654 457.01654 0.2185 97.74 杂质5 C12H10N：O2S3 [M+H+十 395.01616 395.01599 -0.3827 98.48 杂质6 C11H10N6O4S M+H+ 323.05557 323.05570 -0.4180 83.95 2.2杂质1和6的结构鉴定 杂质1和杂质6的[M+H]*峰均为 323.055， formula predictor 预测得到相同分子式CH10N，O4S。杂质1和杂质6[M+H]*峰与头孢替唑[M+H]*峰分别相差 117.9656 和117.9654， 用 formula predictor 推测得到相差结构的分子式为C2H2N2S2，推测为头孢替唑丢失含硫氮杂环和H2所得。 杂环丢失并增加双键的结构有5种，如图3所示。将这5种结构中分为酰胺化合物和季胺两种类型，季铵盐在C18上的保留强于酰胺(离子交换)。杂质1紫外吸收光谱图中有一个吸收峰与主成分类似(255nm)，而杂质6紫外吸收光谱图相对主成分存在明显的红移现象，说明可能有共轭体系生成。由于杂质1与头孢替唑最大吸收波长相似(255nm)，排除有共轭体系生成的结构3-2，3-3和3-4。综合以上信息，杂质1可能的结构为3-1和3-5。将3-1和3-5结构导入ACD/Labs， 所得MS 碎片符合程度最高的为结构3-1。杂质1质谱信息和结构推导如图4所示。 杂质6可能的结构为3-2，3-3和3-4，根据吸收波长紫移红移规则，结构3所形成的共轭体系紫外吸收波长最长(酸、酰胺β位共轭+5nm， 延长一个双键共轭+30nm)，可实现299 nm 处出现最大吸收。将结构3-2，3-3和3-4导入ACD/Labs， 所得MS碎片符合程度最高的为结构3-3。杂质6质谱信息和结构推导如图5所示。由于杂质6为季铵类化合物，其[M+H]*峰与分子量相同，因此杂质6分子式为 CuH1N04S。 图2杂质1和杂质6分子式预测(上)紫外吸收光谱图(下) 3-4 3-5 图3 3杂质1和6可能的结构 图4杂质1质谱图(上)和可能的裂解规律(下) 图5杂质6质谱图(上)和可能的裂解规律(下) 2.3杂质3和杂质4的鉴定 杂质3和杂质4的[M+H]*峰均为 457.0161， formula predictor 预测得到相同分子式 C13H12Ng05S3。杂质3和杂质4的[M+H]+峰与头孢替唑[M+H]+峰分别相差15.9955 和15.9956，即与头孢替唑相差一个氧原子，推测为头孢替唑某氢原子被羟基取代所得。 头孢替唑某氢原子被羟基取代的结构有7种，如图7所示。这7种结构中分为双键或酰胺键α位取代(结构3-7)和非α位取代(1-2)。双键或酰胺键α位羟基取代会均会使得最大吸收波长红移约15 nm。杂质3和4与头孢替唑相比紫移4nm， 推测杂质3和4可能的结构为图7中结构7-1和7-2。将结构7-1和7-2导入ACD/Labs， 所得MS碎片相同且与杂质3和4所得二级质谱信息吻合。ACD/Lab 预测化合物logP值，结构7-1和7-2的 logP分别为-0.19±0.86和0.07±0.86，根据C18疏水保留规律，杂质3可能为结构7-1(图8)，杂质4可能为结构7-2(图9). HO HO HO =O .NH ~OH 7-7 图7杂质3和4可能的结构 图9杂质3质谱图(上)和可能的裂解规律(下) 图9杂质4质谱图(上)和可能的裂解规律(下) 2.4杂质5的鉴定 杂质5的[M+H]*峰为 395.0160， formula predictor 预测得到分子式C12H10Ng0zS3。杂质5的[M+H]*峰与头孢替唑的[M+H]*峰相差46.0050，即与头孢替唑相差 CH202， 推测为头孢替唑羧基被H取代同时丢失H2。杂质5与头孢替唑紫外吸收光谱图相比，最大吸收紫移4nm， 因此新生成的双键与原有双键并非共轭结构，可能结构如图10所示。将图10结构导入ACD/Labs， 所得 MS碎片与杂质5所得二级质谱信息吻合。 mAU CHNO2 图10杂质5质谱图(左上)、光谱图(右上)和可能的裂解规律(下) 结论 经过Q-TOF分析，对头孢替唑钠进行一级质谱信息和二级质谱采集，并结合紫外吸收光谱图、formulapredictor 软件推测杂质分子式和结构信息，所得结构与 ACD/Labs 软件预测相互验证，共鉴定出5个杂质。对低浓度杂质，如杂质6，可采用增加进样量并用 Q-TOF自带的废液阀选择性切入目标杂质的方法实现鉴定。由于Q-TOFLCMS-9030 的高灵敏度，本应用实现了峰面积百分含量从 0.05%到0.6%杂质的结构鉴定。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文利用岛津液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）对抗生素药物头孢替唑钠杂质进行定性分析。通过一级高分辨质谱信息获得准确分子量并用formula predictor预测分子式，结合紫外吸收光谱图推测化合物大致发色基团和可能的不饱和度，将该信息用于分子式的进一步筛选。结合头孢替唑钠[M+H]+峰与杂质[M+H]+峰的差异，以及二级碎片信息，推测可能的杂质结构。将该结构导入ACD/Labs软件，所得碎片与二级质谱匹配，最终筛选得到可能的杂质结构。