食用油脂中饱和烃矿物油检测方案(气相色谱仪)

SSL-CA14-856 Excellence in ScienceGC-136 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 固相萃取-PTV-GC 法测定食用油脂中饱和烃矿物油 GC-136 摘要：本文重点考察固相萃取-程序升温-气相色谱法(去 S(SPE-PTV-GC)测定食用油脂中饱和烃矿物油(MOSH)污染物，并与大容量固相萃取-气相色谱法(LS-SPE-GC)进行了比较，从前处理程序、仪器方法、方法学考察与实际样品测定几个方面比较了两种分析方法。结果表明：不同容量的 SPE 柱对样品净化程序不存在显显性差异(P>0.05) ； PTV-GC与普通 GC在C12~C40碳数分布不存在显著性差异，PTV-GC 在2.5~200 mg/kg 浓度范围内线性良好(R’=0.9991)， GC 在12.5~500 mg/kg 浓度范围内线性良好(R=0.9994)；两种方法测定6种食用油脂中MOSH 的结果没有显著性差异，其回收率和 RSD 值均可以满足检测要求。结果表明 SPE-PTV-GC 和 LS-SPE-GC测定食用油脂中MOSH 不存在显著性差异，二二者均可应用于日常监测，其中 SPE-PTV-GC灵敏度更高，适合低含量污染物的分析。 关键词：食用油脂饱和烃矿物油由(MOSH)气相色谱(GC)利程序升温进样(PTV))E固相萃取 (SPE) 近年来随着毒理学研究的不断深入，食品及包装材料中的矿物油污染引起了各国(尤其是欧盟的关注)，食品中的矿物油污染已经成为食品安全领域的研究热点。矿物油 (mineral oil hydrocarbons，MOH)主要包括直链、支链和烷基取代环状的饱和烃矿物油(Mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH)以及烷基取代的芳香烃 (Mineral oil aromatichydrocarbons， MOAH) 两类。MOSH 的毒性主要体现在其具有生物蓄积性(C16~C35)，而 MOAH 可能具有基因毒性和致癌性。已有研究表明，食用油、婴幼儿食品、谷物等均受到了不同程度的 MOSH 污染。 氢火焰离子化检测器(FID) 因其等碳响应特点成为目前 MOSH 定量测定的首选方法。将 MOSH 从食品基质中分离的前处理方法包括联用技术(液相色谱-气相色谱联用)和离线技术，其中，联用技术具有检出限低、重复性好等优点，但该方法需要昂贵的专用仪器，难以在普通实验室普及，离线技术更适合日常检测。目 实验部分 前已开发的离线技术有正相色谱分离、柱层析及固相萃取 (SPE) 等。SPE因操作简便、省时、省力，成为实验室优选的样品前处理方法，已报道的检测MOSH 的SPE-GC方法有：固相萃取-气相色谱法 (SPE-GC)、大容量固相萃取-气相色谱法(LS-SPE-GC)以以及固相萃取-大体积进样气相色谱法 (SPE-LVI-GC)。 国内对食品中MOSH的测定尚未规定具体的分析方法，常见的 LVI技术如程序升温进样技术(PTV)和冷柱上进样 (on-column) 已被证实用于测定 MOSH时无显著性差异。而 LS-SPE-GC 和 SPE-LVI-GC 方法在MOSH 含量分析的差异尚未有系统研究。 鉴于此，本研究以普通气相色谱和程序升温-气相色谱仪(PTV-GC)为研究对象，通过评估不同规格SPE 柱性能，进样口性能、线性范围、检测限和定量限、回收率，最后使用两种仪器对实际样品分析，从样品制备程序及仪器分析方法考察 LS-SPE-GC和 SPE-GC的区别，最终对两种方法作出对比评价。 1.1仪器 岛津GC-2010 Plus 气相色谱仪两台： 分别配备 SPL 进样系统和 Optic 4多模式进样系统，均采用 FID 检测器。 1.2 GC分析条件 LS-SPE-GC气相色谱 色谱柱： DB-5HT(15m ×0.25 mm×0.1 um) 色谱柱程序升温：35℃(4 min) _25℃ /min370℃ (10 min) 进样口温度：360℃ 进样量：2uL 进样方式：不分流进样 载气控制模式：恒线速度 载气流量：1.3 mL/min 载气类型：氮气 FID 检测器温度：380℃ FID 尾吹流量： 30 mL/min FID空气流量：400 mL/min FID 氢气流量： 40 mL/min PTV-GC气相色谱 色谱柱： DB-5HT (15m×0.25 mm ×0.1 um)PTV温度参数：45℃(1min)_250℃ /min360℃ (22 min) PTV分流比参数：200：1(1min)，关闭分流阀(2 min)， 100：1(至结束) 载气控制模式：恒线速度 载气流量：1.3mL/min 载气类型：氮气 FID 检测器温度：380℃ FID 尾吹流量： 30mL/min FID 空气流量：400 mL/min FID 氢气流量：40 mL/min 1.3样品制备 0.3%银渍硅胶制备称取99g硅胶于1000mL铝箔纸包裹外壁的圆底烧瓶中，用玻璃滴管逐滴加入1% (m/V)硝酸银溶液100 mL，然后用旋蒸仪混匀2~3h， 青置12h，放入烘箱中，70℃干燥1h，随后80℃干燥1h，最后90℃干燥12h。称取37g上述银渍硅胶与63g活化硅胶混匀得到0.3%硝酸银渍硅胶，干燥器内避光保存，2周内使用。 LS-SPE样品前处理称取1g(精确至0.0001 g) 试样于2mL容量瓶中，加入0.02 mg/mL 的正十八烷使用液0.1mL， 正己烷定容，摇匀备用。制备的 SPE大柱(10g) 事先用25mL正己烷预淋洗，流出液弃去。待 SPE 柱中的正己烷近干时一次性加入全部的2mL试液，待试样近干时分2~3次加入7 mL正己烷进行洗脱，待液面近干时，加入15mL正己烷继续洗脱，此时开始收集洗脱液，浓缩至溶液体积为3~5mL时转移至锥底刻度度管中，继续氮吹浓缩至体积小于0.5mL，用正己烷定容至0.5mL， 备用。 SPE 柱样品前处理里量0.2g试样于试管中，加入0.02 mg/mL 的C18内标溶液0.1mL， 摇匀备用。取5 mL玻璃注射器(外层包裹铝箔纸)，底部放入圆形玻璃纤维滤纸(经正己烷浸泡过夜)，装填3g银渍硅胶，轻轻敲实，上面再放入一层滤纸。用10mL正己烷预淋洗 SPE柱，弃去流出液，待液面近干时，加入上述0.1 mL 试液，待 SPE 柱近干时，用3mL正己烷洗脱，待面面近干时，加入5mL正己烷继续洗脱，此时开始收集洗脱液，洗脱液经氮吹浓缩至0.5 mL， 备用。 1.4定量方法 参照测定食用油中的 MOSH 的国际标准 (ISO 17780)的定量方法，以正十八烷 C18 为内标用 C18 峰面积及含量和 MOSH 宽峰峰面积来标定 MOSH 宽峰的含量。 结果与讨论 分析测定结果的不确定性主要与前处理程序，样品分析以及色谱图的分析有关，由于 MOSH 在气相谱图响应为宽峰，需要手动积分计算 MOSH含量，因此，谱图的积分和驼峰范围划分在很大程度上影响了整体的不确定度。然而，也不能忽视前处理程序、仪器分析方法对测定结果的影响。 2.1两种SPE 柱净化效果比较 为了考察样品制备程序对分析结果的影响，选用3种食用油为样品，所有样品一式2份，分别采用10g银渍硅胶 SPE 柱和3g银渍硅胶 SPE 柱净化，浓缩后注入同一台 PTV-GC测定，得到数据采用t-检验方法验证，结果见表1。由表可见，样品羊10 g SPE 柱及 3 g SPE 柱净化得到的 MOSH含量无显著性差异(P>0.05)。因此，前处理净化程序对分析结果无显著性影响。 表1食用油样品经不同容量SPE柱净化的实验结果 样品名 MOSH 含量 (mg/kg) P-value 10g SPE柱 3g SPE柱 山茶油 36.09±0.54 36.76±0.05 0.076 亚麻籽油 12.56±0.23 11.68±0.70 0.355 大豆油 70.67±0.32 70.46±1.93 0.906 2.2方法性能验证 2.2.1 PTV 进样量优化 PTV 进样技术的原理是通过低温进样，将大量溶剂从分流出口排出，把溶质保留在衬管内，随后关闭分流阀，快速升高进样口温度，将溶质完全气化进入色谱柱，因此 PTV进样量是影响目标化合物响应值的重要因素，实验发现，当进样量在10~100 pL范围时， C11~ C40正构烷烃响应量呈线性增加，当进样量达到150pL时，正构烷烃峰展宽变形，因此，进样量选择在 100 uL 以内较为适宜，但由于矿物油样品较“脏”，为了避免检测器过载、保护仪器，本试验选择进样量为 50 uL。 2.2.2 PTV-GC 和普通 GC 进样口性能比较 进样口性能测试是通过连续的10次正正烷烃混标进样来进行测试，在C11~C40范围内，每个烷烃重复性(以变异系数 CV%表示)的平均值分别是 0.96% (GC)和1.26%(6(PTV-GC)，考察不同进样方式的烷烃分布，Cu~C40范围内烷烃平均值的重复性分别是0.52%(GC) 和0.38%((PTV-GC)。以Ci6峰面积为基准，普通 GC 的其他烷烃相对C16响应因子在0.91~1.03范围内， PTV-GC 的C1响应因子为0.75，其余烷烃的响应因子在 0.86~1.00范围内，其中，具有毒理学意义C16~C35的响应因子在0.91~1.0范围，因此， Cn的挥发损失可以忽略，两种仪器在C12~C40碳数范围响应不存在显著性差异。 以不同浓度液体石蜡溶液做标准曲线考察仪器方法的线性范围， PTV-GC 在 2.5~200 mg/kg范围内线性良好(y=1239118.93x-680732.86， R=0.9991)；；普通 GC 在 12.5 mg/kg~500 mg/kg范围内线性良好(y=35630.87x-313617.11，R=0.9994)。 2.2.3定量限比较 MOSH的定量限(LOQ)不能简单通过信噪比计算得到，它与 MOSH 的分子量分布，即与宽峰的宽度密切相关，驼峰灵敏度是正常尖峰的百分之一。前期研究证实，只有进入 FID 的 MOSH总量达到50 ng 以上才能准确定量分析。 采用 SPE-PTV-GC 方法分析食用油脂样品中 MOSH， 将0.2g样品过 SPE 柱净化浓缩至 0.5 mL， 取 50 uL注入GC-FID进行定量分析。整个过过相当于20 mg油样进入FID检测，对应的LOQ值为2.5 mg/kg。即当进样量为50uL时，油样的定量限为 2.5 mg/kg。当进样量为100uL时，油样的定量限为1.25 mg/kg. 采用 LS-SPE-GC 分析食用油脂样品中 MOSH， 将1g样品过 SPE 柱浓缩至0.5 mL时， 取2 uL注入 GC-FID进行定量分析。整个过程相当于4 mg 油样进入FID检测，对应的 LOQ 值为 12.5 mg/kg。 2.2.4回收率比较 由于两种仪器方法的检出限不同，加标浓度不同，各选取一种油样作为样品基质，分别添加不同浓度的液体石蜡标准溶液进行回收率实验，每个样品及空白白行测定6次，计算平均加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。结果表明， SPE-PTV-GC 方法加标回收率在94.5%~103.7%之间， RSD 在0.72%~1.48%之间， LS-SPE-GC 加标回收率在86.7%~92.0%， RSD 在2.62%~4.12%之间，两种方法的回收率和 RSD 值均可以满足检测要求。 表2食用油样品的加标回收率及其相对标准偏差(n=6) 方法 添加浓度(mg/kg) 原始台度 (mg/kg) 测定总浓度(mg/kg) 回收率(%) RSD (%) SPE-PTV-GC 5.00 14.44 99.6 1.32 10.00 9.46 19.83 103.7 1.48 20.00 28.37 94.5 0.72 LS-SPE-GC 12.50 44.73 86.7 3.93 25.00 33.90 56.45 90.2 4.12 50.00 79.91 92.0 2.62 2.3样品分析结果比较 为了避免提取过程的干扰，选用无需提取处理的食用油脂为样品，所有样品一式两份分别采用 SPE-PTV-GC 和LS-SPE-GC分析，每份样品平行分析3次，分析结果见表3。采用t-检验比较两种方法的定量结果，没有显著性差异(P>0.05)，因此两种方法在分析实际样品时不存在显著性差异。对比部分样品的 SPE-PTV-GC 和 LS-SPE-GC 方法得到的谱图(图1)， MOSH 的驼峰形状及碳数分布非常相似，仅在强度上存在差异。SPE-PTV-GC 谱图在低碳数部分表现更好。 表3：分别以SPE-PTV-GC和LS-SPE-GC测定食用油脂样品中的MOSH Sample MOSH content/(mg/kg) C16-C24 content/(mg/kg) C25-C3s content/(mg/kg) C16-C3s content/(mg/kg) PTV-GC GC PTV-GC GC PTV-GC GC PTV-GC GC Chicken fat 24.90±0.7125.04±0.0416.31±0.8316.26±0.29 4.80±0.37 4.96±0.26 21.11±1.2021.22±0.12 Rice oil 33.46±1.05 33.48±0.92 4.80±0.08 4.70±0.32 15.46±0.57 15.80±0.27 20.05±0.39 20.47±0.47 Linseed oil 46.73±0.7846.60±0.20 15.46±0.05 15.89±0.48 22.56±0.56 2 22.16±0.94 38.06±0.6838.40±0.32 Walnut oil 43.54±0.64 43.13±0.30 11.94±0.08 11.53±0.26 21.49±0.74 21.68±0.31 32.81±0.6631.27±0.48 Sesame oil 59.59±0.10 59.31±0.63 4.27±0.04 4.66±0.09 28.85±0.03 29.50±0.36 33.11±0.0833.92±0.07 Camellia oil 92.37±0.16 92.37±0.72 4.73±0.04 4.54±0.84 63.76±0.52 64.42±0.47 68.49±0.2268.38±0.78 图1应用SPE-PTV-GC和LS-SPE-GC分别测定同批油脂样品的MOSH谱图比较 结论 本文对比了 SPE-PTV-GC 和 LS-SPE-GC 两种方法在 MOSH 含量的测定的差异，发现两种方法在分析实际样品时没有显著性差异，均可应用于日常监测。其中，大体积进样能够显著提高方法的灵敏度，减少了样品和试剂消耗，降低样品污染的风险，避免低沸点物质过度挥发，因此 SPE-PTV-GC 适合低含量污染物的分析。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文重点考察固相萃取-程序升温-气相色谱法（SPE-PTV-GC）测定食用油脂中饱和烃矿物油（MOSH）污染物，并与大容量固相萃取-气相色谱法（LS-SPE-GC）进行了比较，从前处理程序、仪器方法、方法学考察与实际样品测定几个方面比较了两种分析方法。结果表明：不同容量的SPE柱对样品净化程序不存在显著性差异（P>0.05）；PTV-GC与普通GC在C12~C40碳数分布不存在显著性差异，PTV-GC在2.5~200 mg/kg浓度范围内线性良好（R2=0.9991），GC在12.5~500 mg/kg浓度范围内线性良好（R2=0.9994）；两种方法测定6种食用油脂中MOSH的结果没有显著性差异，其回收率和RSD值均可以满足检测要求。结果表明SPE-PTV-GC和LS-SPE-GC测定食用油脂中MOSH不存在显著性差异，二者均可应用与日常监测，其中SPE-PTV-GC灵敏度更高，适合低含量污染物的分析。