血清中形态砷检测方案(等离子体质谱)

SSL-CA14-853Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-081 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区宜路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai HPLC-ICPMS测定血清中的形态砷 ICPMS-081 摘要：通过 HPLC-ICPMS 联用测定了血清中四种有毒形态砷。采用乙腈沉淀蛋白、离心、氮吹后经阴离子交换柱分离、ICP-MS测定。各种形态砷在1~50 ug/L范围回归系数大于0.999，检出限0.09~0.23 ug/L，样品加标回收率为85.7%~113%，考察了基质效应对砷胆碱和砷甜菜碱两种低毒有机砷的分离影响。该方法适用于血液样品中有毒形态砷的分析测定。 关键词： HPLCICP-MS 血液砷形态 砷是一种有毒元素，砷矿的开采和熔炼、.工业废料的排放、含砷农用化学品如杀虫剂、除草剂等的使用导致了砷环境污染。人体中的砷主要通过食物摄取在体内积累，会造成急性或慢性中毒，可致畸、致突变、致癌等。 砷的毒性与它的化学形态有关，不同价态、形态的砷，其毒性差别很大，无机砷毒性远远大于有机砷。砷形态主要有亚砷酸盐(AsIII)、砷酸盐(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、砷糖、砷脂及阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷等。由于测定砷总量不能反映准确的暴露水平，因此形态分析受到越来越多的关注与重视。 除了通过食品、饮用水等可能摄入有害砷之外，作为对疾病有特定作用的元素，砷化合物常用于抗肿瘤药物中，部分传统中药中也常含有砷。血液作为人体的重要组成部分，有毒有害的砷含量，尤其是毒性大的无机砷(亚砷酸盐和砷酸盐)形态检测具有重要的健康意义，也可监测含砷制剂使用在血液中的分布与转化。 高效液相色谱可以将不同形态砷有效分离，电感耦合等离子体质谱具有抗干扰能力强、灵敏度高和线性范围宽的特点，因此 HPLC-ICPMS已成为砷元素形态分析中最具有应用前景的技术之一。 实验部分 1.1对照品 砷酸(AsO3， AsV)、亚砷酸(AsO4， AslIl)、一甲基砷(CH，AsO3，MMA)、二甲基砷(CHAs0，DMA)、砷甜菜碱 (C5H1As02， AsB) 和砷胆碱 (CsH14AsBrO， AsC)标准物质，中国计量科学研究院国家标准物质研究中心。 1.2实验检材 血清，北京朝阳医院。 1.3仪器 岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai 和ICPMS-2030 电感耦合等离子体质谱仪，低温高速离心机，旋涡混合器，氮吹仪。 1.4试剂 碳酸铵，氨水，乙腈，甲醇。 方法和结果 2.1对照品溶液配制 分别移取不同形态砷标准溶液，用纯水稀释为0、1、2、5、10、50 ug/L的标准序列。 2.2样品的处理方法 取300 uL 血清于离心管中，加入300 uL乙腈，涡旋混合器振动2 min， 10000 r/min、4℃离心10 min， 然后取400 uL上清液于离心管中，氮吹吹干后加入200uL纯水复溶、涡旋摇匀后待测。同时相同步骤做空白和加标回收试验。 2.3色谱条件 液相色谱条件及梯度洗脱程序见表1和表2。 表1 HPLC色谱条件 参数 设定值 色谱柱 DionexlonPacTM AS197.5 um 250*4 mm 流动相 A： 0.1%甲醇水； B： 50mmol/L碳酸铵水溶液， pH9.0 流速 1.0 mL/min 柱温 30℃ 进样量 20 uL 洗针液 水 洗脱程序 梯度洗脱 表2 HPLC梯度洗脱程序 时间 (min) 流速((mL/min) 流动相A相 流动相B 相 0 1.00 100 0 1.0 1.00 100 0 11.0 1.00 0 100 11.1 1.00 100 0 20.0 1.00 100 0 2.4质谱条件 ICPMS-2030 仪器分析条件见表3。 表3 ICP-MS分析条件 仪器参数 设定值 仪器参数 设定值 高频功率 1.20kW 等离子体气流速 8.0 L/min 辅助气流速 1.10 L/min 载气流速 0.70 L/min 炬管类型 Mini炬管 雾化器类型 同轴 雾化室 旋流 雾化室温度 5℃ 采样深度 5.0 mm 高频频率 27.12 MHz 碰撞气种类 He 碰撞气流速 5.0 mL/min 池电压 -21V 能量过滤器电压 5.0V 结果与讨论 3.1色谱分离图 对空白进行考察排除系统干扰，并且考察混合标准溶液中六种形态砷的分离度，以确保实际样品分析过程中不存在假阳性检出。图1所示为标准溶液(5ug/L) 色谱分离图(单位 kcps) ， AsC、AsB、AsIII、DMA、MMA、AsV保留时间分别为 1.971、2.307、6.528、6.931、11.206、13.101 min。 图1六种形态砷混合标准溶液色谱图 3.2线性关系 对各种形态砷峰面积及浓度绘制标准曲线，浓度范围为 1~50 ug/L，结果如图2至图5所示，线性相关系数均大于0.999. 图2亚砷酸(AsIII)标准曲线 (r=0.9998) 图4一甲基砷(MMA)标准曲线(r=0.9996) 图33.二甲基砷(DMA)标准曲线(r=0.9999) 图5砷酸(AsV)标准曲线 (r=0.9993) 3.3检出限 对浓度为1 ug/L的溶液考察形态砷的信噪比，以三倍信噪比(S/N)峰高对应浓度作为检出限，1ug/L样品色谱图、基线及检出限结果分别见图6、图7和表4，四种形态砷检出限为 0.09~0.23 ug/L。 图6六种1ug/L形态砷色谱图 图7色谱分离基线 表4匹四种形态砷检出限 名称 仪器检出限 (ug/L) 方法检出限(ug/L) 亚砷酸根 0.23 0.23 二甲基砷 0.09 0.09 一甲基砷 0.20 0.20 砷酸根 0.18 0.18 3.4样品测试 取血清样品，按照前处理程序处理后测定，色谱图见图8，测定结果见表5，亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷、砷酸根四种有毒形态形精密度1.14~4.45%，加标回收率为85.7%~113%，回收率良好。 图8血清及加标样品色谱图 表5血清测试结果及加标回收 形态 样品 加标 2ug/L 加标 5 ug/L 结果 测定值 RSD 回收率 测定值 RSD 回收率 (ug/L) (n=3，%) (%) (ug/L) (n=3，%) (%) 亚砷酸根 N.D. 2.26 1.77 113 5.27 1.14 105 二甲基砷 N.D. 1.74 1.15 87.0 4.29 1.98 85.7 一甲基砷 N.D. 2.03 1.23 101 4.73 3.07 94.5 砷酸根 N.D. 1.87 4.45 93.3 4.79 2.71 95.8 备注： N.D.表示未检出。 3.5基体效应 使用色谱柱 AS19 对六种形态砷分离时砷胆碱和砷甜菜碱的分离度较低，由于血液样品基质复杂，导致经乙腈沉淀蛋白和超滤(3K道尔顿)两种方法处理的血清原样检测时砷胆碱保留时间延后，和砷甜菜碱峰重合在一起，样品逐级稀释到20倍后保留时间与标准溶液一致，色谱图见图9.由于未受砷暴露的正常人体血液中总砷含量少，不同形态的砷含量会更低，稀释倍数增大后可能导致各种形态砷不能准确定量检出。由于原样检测时主要影响砷胆碱和砷甜菜碱的分离度，且这两种砷形态毒性很小，在实际应用中可原样分析毒性大的亚砷酸根、砷酸根及毒性较弱的一甲基砷、.二甲基砷，保证血清中有毒形态砷的准确定量。 图9基质对砷胆碱和砷甜菜碱分离的影响 结论 使用岛津惰性液相系统 LC-20Ai 和 ICPMS-2030型电感耦合等离子体质谱仪联用测定了血清样品中有毒形态砷含量。该方法灵敏度高，方法检出限0.09~0.23ug/L， 测定结果准确，样品加标回收率为85.7%~113%，可适用于血清样品中有毒形态砷的分析测定。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 通过HPLC-ICPMS联用测定了血清中四种有毒形态砷。采用乙腈沉淀蛋白、离心、氮吹后经阴离子交换柱分离、ICP-MS测定。各种形态砷在1~50 μg/L范围回归系数大于0.999，检出限0.09 ~0.23 μg/L，样品加标回收率为85.7%~113%，考察了基质效应对砷胆碱和砷甜菜碱两种低毒有机砷的分离影响。该方法适用于血液样品中有毒形态砷的分析测定。