血清中脂溶性维生素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-864Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-373 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 应用 LCMS-8050 CL 检测人血清中脂溶性维生素含量 LCMSMS-373 摘要：本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及广州达瑞品牌脂溶性维生素检测试剂盒(串联质谱法)，建立了人体血清中维生素A、25-羟基维生素 D2、25-羟基维生素D3和维生素E四种脂溶性维生素同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度及稳定性的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对维生素 A/D/E缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。 关键词： LCMS-8050CL 维生素 A 25-羟基维生素 D2 25-羟基维生素D3维生素E人血清 维生素A(VA)、维生素 D(VD) 和维生素 E(VE)均为脂溶性维生素。维生素A缺乏病是由于膳食中维生素A或其前体胡萝卜素缺少或吸收不良而引起的全身性疾病，其主要病理变化是全身上皮组织角质变性，于眼部出现最早，可引起视觉功能异常，并影响呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的黏膜，乃至皮肤、骨骼及免疫系统。维生素D，俗称“阳光维生素”，主要生理功能是将血钙和血磷水平维持在正常范围内，以维持大部分生命过程不可或缺的代谢功能，对于维持钙的代谢和骨骼健康至关重要。血清中250HD2 和250HD3的浓度测量，已经应用于监控人体内维生素D的状况及低血钙代谢性骨疾病和高血钙代谢性骨疾病的鉴别诊断。维生素E是体内生物膜上的重要组成部分，当维生素E缺乏时，生物 膜上的多不饱和脂肪酸容易发生过氧化反应，特别是微粒体和线粒体的膜；并且当维生素E缺乏时，红细胞膜上的多不饱和脂肪酸易发生过氧化反应，使红细胞的膜受损，产生溶血，出现贫血症状。由于遇光遇热热稳定，且血清中含有大量干扰物质等，血清中脂溶性维生素的测定十分困难。 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及广州达瑞品牌脂溶性维生素检测试剂盒(串联质谱法)，建立了人体血清中维生素A、25-羟基维生素 D2、25-羟基维生素D3、维生素E的含量测定方法，对维生素 A/D/E 缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL与三重四重杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为 LC-30ADCL×2(输液泵))， DGU-20A5R CL (线线脱气机)， SIL-30ACMP CL (自动进样器)， CTO-30ACL(柱温箱))，， CBM-20A CL 系统控制器， LCMS-8050 CL 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.60 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISTC18 (2.1mml.D.× 50 mm L.， 2um) 流动相：A相-0.1%甲酸-1mM乙酸铵水B相-0.1%甲酸-1mM乙酸铵甲醇 流速： 0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：10uL 自动进样器温度：4C 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为75%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 98 5.50 Pumps Pump B Conc. 98 5.51 Pumps Pump B Conc. 75 7.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8050 CL DL温度：150℃ 离子源： ESI(+) 加热模块温度：500℃ 雾化气流速： 3.0L/min 干燥气流速：15.0L/min 加热气流速：5.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：350℃ MRM参数：见表2 表2 MRM参数 名称 前体离子 产物离子 驻留时间(ms) Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) VA 269.25 93.20 28 -18 -21 -10 d6-VA 275.30 96.20 28 -16 -11 -34 250HD2 413.30 337.30 28 -14 -11 -23 d6-250HD2 419.35 355.45 28 -24 -11 -18 250HD3 401.40 365.35 28 -24 -11 -26 d6-250HD3 407.35 371.45 28 -24 -12 -18 VE 431.40 165.10 28 -14 -35 -28 d6-VE 437.40 171.20 28 -14 -21 -28 1.3标准品、质控品及样品制备 使用脂溶性维生素检测试剂盒(串联质谱法，广州达瑞生物公司)。该试剂盒包含以下部分： 标准物质：6个水平的标准品牛血清白蛋白冻干粉 质控品：2个水平的质控品牛血清白蛋白冻干粉 内标：含d6-VA、d6-250HD2、d6-250HD3和d6-VE四种内标的牛血清白蛋白冻干粉 蛋白沉淀剂：40mL 样品释放剂：100mL 样品复溶液：20mL 标准品、质控品和内标配制： 标准品(A、B、C、D、E、F)和质控品(C1、C2)：室温条件下，准确量取 1000 uL纯水至每瓶校准品或质控品中，至冻干粉完全溶解(不少于20分钟)，备用，具体浓度见表3。 内标：室温条件下，准确量取1000 uL纯水至内标瓶中，至冻干粉完全溶解(不小于20分钟))，备用， 具体浓度见表3. 内标工作液：按内标比蛋白沉淀剂等于1比24，把内标储液稀释25倍，配制成内标工作液(1.0mL内标准品+24mL 蛋白沉淀剂)。 表3标准品及质控品浓度(ng/mL) 编号 A B C D E F C1 C2 VA 0 80 256 521 1101 3418 453 1349 250HD2 0 2.6 7.3 13.6 24.9 74.8 10.4 39.9 250HD3 2.9 7.5 15.1 27.5 82.4 10.9 51.1 VE 678 1852 3695 7117 21388 3735 11253 标准品、质控品和样品前处理方法： 分别精密吸取 100uL标准品、质控品或血清样品溶液于2mL离心管中，然后加入200 uL内标工作液，涡旋30s；再加入450 uL样本释放剂，充分振摇15 min， 然后13000 rpm 离心15 min；离心后吸取350 uL上清液至1.5mL离心管，氮气室温彻底吹干；然后加入100 uL样品复溶液，振荡孵育5 min， 转移至1.5 mL 进样瓶， LCMS分析，进样量 10 pL。 结果与讨论 2.1 MRM色谱图 图1标准曲线最低浓度点色谱图(B点) 2.2线性关系 采用内标法建立标准曲线，连续考察3天，结果如表4与表5所示。结果显示， VA 在 80~1349 ng/mL、250HD2在2.6~39.9 ng/mL、250HD3在2.9~51.1 ng/mL、VE在678~11253 ng/mL线性浓度范围内线性相关性良好，相关系数均在0.994以上。 3 表5标准曲线结果 批次 1 2 3 目标物 线性方程 相关系数 准确度(%) VA Y=(0.121185)X+(-1.61691) 0.9995 97.0~103.8 250HD2 Y=(0.0368731)X+(-0.0158060) 0.9989 94.9~104.3 250HD3 Y=(0.0551478)X+(-0.0407025) 0.9989 94.6~104.0 VE Y=(0.00792136)X+(-1.12147) 0.9987 93.2~103.7 VA Y=(0.111209)X+(-1.58351) 0.9998 98.3~102.3 250HD2 Y=(0.0357558)X+(-0.0224918) 0.9945 85.8~108.3 250HD3 Y=(0.0553091)X+(-0.0483678) 0.9992 96.1~104.5 VE Y=(0.00749441)X+(-1.13542) 0.9984 92.3~104.0 VA Y=(0.105759)X+(-1.65509) 0.9978 92.4~107.8 250HD2 Y=(0.0319866)X+(-0.0242523) 0.9963 91.1~107.3 250HD3 Y=(0.0544391)X+(-0.0303690) 0.9991 96.0~104.8 VE Y=(0.00728962)X+(-1.47648) 0.9985 95.3~107.2 2.3 精密度验证 取处理后人血清样品，连续进样分析5次，结果如表6所示，结果显示，所测定四种物质精密度在2.6%~4.0%之间，符合日常检测需求。 表6精密度考察结果 (ng/mL) 编号 VA 250HD2 250HD3 VE 1 610.4 13.3 15.3 4537.0 2 601.5 14.3 15.3 4807.6 3 623.2 13.7 14.5 4708.8 4 628.4 14.5 15.7 4788.7 5 642.9 14.7 15.3 5003.0 平均值 621.3 14.1 15.2 4769.0 CV% 2.6 4.0 2.9 3.5 2.4质控样本准确度考察 按1.2中的分析条件和1.3中的前处理方法连续三天对试剂盒中的质控品进行分析，质控品的准确度结果如表7所示，结果显示质控品测定结果与理论值接近，完全符合试剂盒质控品准确度85%~115%的要求。低浓度质控品(C1)三天测定结果准确度在88.8%~109.7%之间，高浓度质控品(C2)三天测定结果准确度在87.2%~111.9%之间。 表7日内及日间精密度考察结果 编号 DAY 1 DAY2 DAY3 测定值 准确度 测定值 准确度 测定值 准确度 (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) C1-VA 410.6 90.6 451.2 99.6 402.5 88.8 C1-25-OHD2 9.33 89.7 10.6 101.8 10.1 96.8 C1-25-OHD3 11.96 109.7 10.8 99.2 10.7 97.7 C1-VE 3561.9 95.4 3674.4 98.4 4077.2 109.2 C2-VA 1226.8 90.9 1297.4 96.2 1266.6 93.9 C2-25-OHD2 43.3 108.5 44.6 111.9 42.0 105.4 C2-25-OHD3 51.4 100.6 52.4 102.6 53.6 105.0 C2-VE 9812.0 87.2 10246.0 91.1 11000.1 97.8 2.5临床样品测定结果 取3批次血清样品，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见表8. 表83人血清临床样品检测结果 编号 VA(ng/mL) 250HD2(ng/mL) 250HD3(ng/mL) VE(ng/mL) Sample-1 610.4 13.3 15.3 4537.0 Sample-2 1851.3 1.3 25.8 14709.0 Sample-3 1216.9 0.9 27.2 9823.5 结论 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL 及广州达瑞品牌脂溶性维生素检测试剂盒(串联质谱法)，建立了人体血清中维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E四种脂溶性维生素同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度及稳定性的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于 0.994， 准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对维生素A/D/E缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL及广州达瑞品牌脂溶性维生素检测试剂盒（串联质谱法），建立了人体血清中维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E四种脂溶性维生素同时测定的方法。使用试剂盒的内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度、精密度及稳定性的考察。结果显示该方法专属性良好，标准曲线相关系数均大于0.994，准确度及精密度均满足试剂盒要求。该方法对维生素A/D/E 缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。