血液中地西泮、阿普唑仑、三唑仑、艾司唑仑、硝基西泮、氯硝西泮检测方案(超临界色谱)

超临界萃取-超临界色谱-质谱联用(SFE-SFC-MS)检测血液中常见毒物的应用研究 摘要：建立了一种在线超灵界萃取、超临界色谱和质谱联用相结合的检测分析方法。方法 取3mm的干斑置于提取器中，上样分析。结果测定6种毒物的线性范围在10~1000 ng/mL， 回收率均在68.8~110.2之间，检出限在1~10 ng/mL之间。整个方法具有简便，快速，准确、灵敏度高等特点，为检验血中的毒物提供了一种全新的分析方法。 关键词： 超临界萃取 超临界色谱 血 毒物 1材料与方法 1.1试剂和材料 标准对照品：地西泮(diazepam) 阿普唑仑(alprazolam)、三唑仑(triazolam)、艾司唑仑(estazolam)、硝基西泮(nitrazepam)、氯硝西泮 (clonazepam)购自公安部物证鉴定中心。以上纯品均用甲醇配制成1mg/mL 的标准溶液。 Whatman 903 DBS卡购自T通用电气医疗集团。 Nexera UC 在线超临界萃取-超临界色谱仪(岛津)； LCMS-8040 三重四极杆质谱仪(岛津)。 1.2 仪器条件 1.2.1超临界萃取条件 1.2.2 超临界色谱-串联质谱仪条件 色谱柱为岛津 GL 公司色谱柱 (Inetersil SIL 4.6 mm I.D.x150 mmL.，5 pm)；柱温：40℃；流动相A： CO2；流动相B(改性剂)：甲醇；流速：3mL/min；萃取及洗脱程序见表1。 表1流动相和梯度洗脱条件 Time Module Commond Value 2.00 SFE Extraction Valve Dynamic 4.00 SFE End 4.00 Pumps Pump B Conc. 10 4.01 Pumps Pump B Conc. 20 10.00 Pumps Pump B Conc. 20 18.00 Pumps Pump B Conc. 100 20.01 Pumps Pump B Conc. 100 20.01 SFE Wash 20.02 Pumps Shut Off Valve(Pump A) Close 21.99 Pumps Pump B Conc. 100 22.00 Pumps Pump B Conc. 0 22.00 Pumps Total Flow 3 22.01 Pumps Total Flow 0 22.02 Pumps Shut Off Valve(Pump A) Open 22.49 Pumps Shut Off Valve(Pump A) Open(Pump On) 22.50 SFE Extraction Valve Static 22.50 Pumps Total Flow 0 22.51 Pumps Total Flow 3 22.51 SFE Vent Valve Vent 25.50 Controller Stop 质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；雾化气流速：3.0L/min；干燥器流速：15L/min； DL温度：200℃；加热模块温度：400℃；MRM参数见表2. 表2监测离子对和碰撞能 名称 保留时间(min) 定量离子对 定性离子对 碰撞能量(eV) 定量/定性 地西泮 5.550 285.10>193.10 285.10>154.10 -32/-28 硝西泮 6.353 282.05>236.10 282.05>207.25 -24/-35 氯硝西泮 6.474 316.00>270.05 316.00>241.05 -25/-37 艾司唑仑 9.408 295.10>267.05 295.10>267.05 -25/-45 阿普唑仑 10.231 309.10>205.10 309.10>281.00 -45/-25 三唑仑 10.902 343.00>308.05 343.00>238.90 -28/-35 1.3 样品处理 标准品的制备：将1000 ng/mL 的标准混合液，使用甲醇稀释至500、200、100、50、10 ng/mL的标准溶液，用于校准曲线的制作。每份标准溶液取 20 uL 点样到 Whatman 903 DBS 卡上。室温晾干后打孔取直径3 mm 的干斑置于提取器中，上样分析。 样品的制备：取20 uL人血点样到 Whatman 903 DBS卡上，室温晾干后打孔取直径3 mm的干斑置于提取器中，上样分析。 2结果与讨论 2.1 超临界萃取条件的优化 试验以萃取改性剂的用量、萃取压力和萃取温度为变量，，以目标物的峰面积为评价萃取效率的优劣。 2.1.1萃取改性剂的选择 由于目标物质极性较大，仅使用弱极性的 CO2很难将目标物质提取出来，因此，加入适量的改性剂是首要选择。本试验使用甲醇作为改性剂，考察了甲醇的用量为5%、10%和15%对提取量的影响。结果显示10%的用量最佳。甲醇用量与目标毒物峰面积关系如图所示。 2.1.2萃取压力的选择 2.1.3萃取温度的选择 在其他条件不变情况下，考察了萃取温度对血中毒物的萃取能力。从图萃取温度对峰面积的曲线可以看出，存在最佳的萃取温度。且，从图中明显看出，对于多数毒物，1，当萃取温度 达到60℃时，峰面积最小。 2.2 MRM色谱图 200 ng/mL 人血加标样品的色谱图如下图所示，6种毒物得到了较好的分离。使用在线SFE-SFC系统，从提取到分离分析仅需要25分钟。大大节省了整个分析周期。 2.3检出限、线性范围和回收率 用所建立的方法进行了一些分析物定量分析的线性关系和回收率的考察。分别在 DBS卡上加入不同浓度的标准溶液进行分析，将分析物色谱峰面积比与浓度进行回归，得线性方程及相关系数见表3。测试200 ng/mL 浓度的人血加标样品，平行测定3次，取平均值作为回收率结果，同时计算3次样品的相对标准偏差作为精密度评价，以上实验结果一并列入表3中。根据分析物峰高与含量成正比，计算出分析物色谱峰高相当于基线噪音强度三倍检材中分析物浓度。各药物的检出限(S/N=3)在 1~10 ng/mL 之间。 表16种常见镇静药物的线性关系和回收率 药物组分 t (min) 线性范围 相关系数 LOD 回收率 RSD (ng/mL) (R2) (ng/mL) (%) (%，n=3) 地西泮 5.338 10~500 0.994 2 99.1 13.6 硝西洋 6.458 50~1000 0.992 8 110.2 15.4 氯硝西泮 6.574 50~1000 0.996 8 94.4 20.2 艾司唑仑 9.962 10~500 0.999 1 78.0 16.7 阿普唑仑 10.828 10~500 0.996 1 107.9 18.8 三唑仑 11.733 50~1000 0.992 10 68.8 18.4 3小结 本文建立了使用超临界萃取-超临界色谱质谱在线提取和分析人血中的6种安眠类的方法。该方法具有自动化程度高、提取时间短、样品用量少、环境污染小等优点，操作省时省力，而且该方法对分析人员的要求较低、精密度、检出限等各项方法学指标均符合法庭科学毒物分析的要求，为检验血中的毒物分析检测提供了一种全新的快速提取分析方法。 .X 本文建立了一种在线超灵界萃取、超临界色谱和质谱联用相结合的检测分析方法。测定6种毒物的线性范围在10~1000 ng/mL，回收率均在68.8~110.2之间，检出限在1~10 ng/mL之间。整个方法具有简便，快速，准确、灵敏度高等特点，为检验血中的毒物提供了一种全新的分析方法。