抗疲劳饮料中90种那非类物质检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-252Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-022 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 岛津四极杆飞行时间串联质谱仪LCMS-9030定性筛查抗疲劳饮料中90种那非类物质 LCMS-QTOF-022 摘要：本文利用岛津 LCMS-9030 超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪，建立了定性筛查抗疲劳饮料中90种那非类物质的方法。结合保留时间、一级质谱准确质量数和同位素丰度评价信息实现90种那非类化合物的快速定性筛查。一级质谱准确质量数相对误差均小于2.0 ppm， 优于定性的一般要求(小于5ppm)。建立了90种那非类化合物的二级质谱库，使用二级质谱库搜索匹配评价功能可进行进一步的确确。使用抗疲劳饮料加标样品考察方法检出限，90种那非类物质方法检出限在 0.003~0.490 mg/L之间。使用该方法测试了抗疲劳饮料样品，检出西地那非，其一级质谱质量数相对误差为 0.44 ppm， 检索得分为97.55分，同位素丰度匹配得分为97.47， 二级质谱信息搜索匹配相似度为94%。 关键词： LCMS-9030 四极杆飞行时间质谱 那非类物质抗疲劳饮料 那非类物质是最重要的一类人体内5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5， PDE-5)抑制剂， 可用于治疗男性勃起功能障碍。该类物质已知的副作用包括面部潮红、头晕、头痛、鼻塞和视觉异常等，严重的会导致死亡，是一种须在医生指导下服用的处方药。 近年来，随着化学合成技术的进步，一些具有PDE5 抑制活性的那非类衍生物不断涌现，被一些不法分子添加至标示或暗示具有补肾壮阳、抗疲劳、改善免疫力等作用的食品中，对服用者健康和生命安全造成严重威胁。我国《食品安全法》第三十八条规定，生产经营的食品中不得添加药品，但是可以添加按照 传统既是食品又是中药材的物质。那非类物质是处方药，在食品或保健食品等特殊食品中添加属于违法行为，必须予以打击。 本文参考国家市场监督管理总局发布的《食品中那非类物质的测定(BJS 201805)》食品补充检验方法，利用岛津LCMS-9030 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱仪，建立了一种定性筛查抗疲劳饮料中90种那非类物质的方法。本方法简便、快速、准确、灵敏度高，无需标准物质即可快速定性筛查90种那非类物质。供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 岛津 LCMS-9030 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪，具体配置：LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LCMS-9030 四极杆飞行时间质谱仪， LabSolutions V 5.96 工作站软件， LabSolutions Insight Explore V 3.4(用于同位素丰度评价和分子式预测) 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mm l.D.× 150 mm L.， 2.0 um (P/N： 227-30001-05， SGLC) 流动相：A相-0.1%甲酸；B相-甲醇 洗针模式：进样前后洗针， External only (进样针外壁清洗) ， Rinse Port 流速：0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样体积：1uL 洗针液：甲醇/水=1：1(v：v) 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为15%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 泵 B.Conc 50 16.00 泵 B.Conc 65 19.00 泵 B.Conc 98 22.00 泵 B.Conc 98 22.10 泵 B.Conc 15 25.00 控制器 Stop 质谱条件 离子源： ESI(+) DL管温度：250℃ 接口电压：4.0kV 加热块温度：400℃ 雾化气：3.0 L/min 加热气流量：10.0 L/min 校准方法：外标法校准质量数(Nal)，分辨率>30000 (m/z1972)，质量误差<2 ppm 干燥气流量：10.0L/min 扫描模式： MMSS SSccana n(m/z 200-1000) & MS/MS (m/z 10-900)接口温度：300℃ 1.3样品前处理 取试样适量摇匀，准确吸取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取 15 min，放冷至室温，用甲醇定容，经有机相微孔滤膜过滤，取滤液待测。 结果与讨论 2.1准确质量数提取结果 90 种那非类化合物提取离子流色谱图(EIC)如图1所示。 图1190种那非类物质 EIC图(10ng/mL) 2.2方法检出限 配制浓度 0.5 mg/L的抗疲劳饮料加标样品，按照上述前处理方法处理后，上机进行测定，90种那非类物质的方法检出限(ASTM， S/N=3) 为 0.003~0.490 mg/L，具体结果表2。 表290种那非类化合物方法检出限 37 二硫代去甲基卡巴地那非 0.035 82 丙氧苯基硫代豪莫西地那非 0.033 38 酮红地那非 0.200 83 二硫代去乙基卡巴地那非 0.017 39 N-辛基去甲他达拉非 0.300 84 羟基硫代红地那非 0.014 40 双酮红地那非 0.018 85 他达拉非二氯代杂质 0.026 41 羟基硫代伐地那非 0.035 86 西地那非杂质12 0.007 42 环戊那非 0.055 87 去甲基哌嗪基西地那非磺酸 0.267 43 丙氧苯基硫代 0.020 88 丙氧苯基艾地那非 0.015 羟基豪莫西地那非 44 苄西地那非 0.007 89 西地那非杂质14 0.088 45 桂地那非 0.026 90 丙氧苯基异丁基艾地那非 0.013 2.3一级质谱质量数准确度考察 配制0.5 mg/L 90种那非类化合物的抗疲劳饮料加标样品溶液，按照前述条件进行前处理，上机分析，进行一级MS扫描，根据90种那非类化合物的准确质荷比信息，考察各化合物的质量数准确度，结果见表3。由测试结果可知，90种那非类化合物准确质量数实测值与理论值的相对误差均小于2.0 ppm，优于定性的一般要求(小于5ppm)。 表3抗疲劳饮料加标样品中90种那非类化合物的准确质量数相对误差 编 号 中文名 英文名 CAS# 分子式 RT (min) 离子 类型 理论 m/z 实测 m/z 相对误差 (ppm) 1 西地那非 Sildenafil 139755-83-2 C22H30N604S 5.752 M+H]+ 475.21220 475.21234 0.29 2 他达拉非 Tadalafil 171596-29-5 C22H19N304 10.311 [M+H]+ 390.14483 390.14492 0.22 3 脱硫伐地 那非 Imidazosagatriaz- inone 139756-21-1 C17H20N402 18.602 M+H+ 313.16590 313.16616 0.82 4 庆地那非 Gendenafil 147676-66-2 C19H22N403 15.474 M+H+ 355.17647 355.17637 -0.27 5 那非乙酰酸 Acetil acid 147676-78-6 C18H20N404 13.605 M+H+ 357.15573 357.15571 -0.06 6 苯酰胺那非 Xanthoanthrafil 1020251-53-9 C19H23N306 8.309 [M+H+ 390.16596 390.16605 0.23 7 氨基他达 拉非 Aminotadalafil 385769-84-6 C21H18N404 8.215 M+H]+ 391.14008 391.14001 -0.18 8 他达拉非甲 基氯化物 Chloropretadalafil 171489-59-1 C22H19CIN205 13.686 [M+H+ 427.10553 427.10536 -0.39 9 苯噻啶红地 那非 Piperiacetildenafil 147676-50-4 C24H31N503 5.439 M+H+ 438.24997 438.25017 0.47 10 那红地那非 Noracetildenafil 949091-38-7 C24H32N603 5.156 M+H+ 453.26087 4453.26112 0.56 11 卡巴地那非 Carbodenafil 944241-52-5 C24H32N603 4.415 [M+H]+ 453.26087 453.26099 0.28 12 伪伐地那非 Pseudovardenafil 224788-34-5 C22H29N，O4S 17.427 M+H+ 460.20130 460.20152 0.47 13 那莫西地 那非 Norneosildenafil 371959-09-0 C22H29N504S 18.354 M+H]+ 460.20130 460.20174 0.95 14 N-去乙基伐 地那非 N-Desethylvarde- nafil 448184-46-1 C21H28N604S 5.350 M+H+ 461.19655 461.19687 0.69 15 N-去甲基西 地那非 N-Desmethyl- sildenafil 139755-82-1 C21H28N604S 5.850 M+H+ 461.19655 461.19676 0.45 _ 16 红地那非 Acetildenafil 831217-01-7 C25H34N603 5.351 M+H+ 467.27652 467.27677 0.54 17 羟基红地 那非 Hydroxyacetilde- nafil 147676-56-0 C25H34N，04 5.094 M+H+ 483.27143 483.27175 0.66 18 阿伐那非 Avanafil 330784-47-9 C23H26CIN-03 5.327 M+H+ 484.18584 484.18614 0.62 19 艾地那非 Aildenafil 496835-35-9 C23H32N，04S 6.395 M+H+ 489.22785 489.22818 0.67 20 豪莫西地 那非 Homosildenafil 642928-07-2 C23H32N，O4S 5.855 M+H+ 489.22785 489.22812 0.55 21 伐地那非 Vardenafil 224785-90-4 C23H32N，04S 5.383 M+H+ 489.22785 489.22822 0.75 22 硫代西地 那非 Thiosildenafil 479073-79-5 CC22H30N03S2 11.858 M+H+ 491.18936 491.18958 0.45 23 硫代豪莫西 地那非 Thiohomosilde- nafil 479073-80-8 C23H32N，03S2 11.971 M+H]+ 505.20501 505.20526 0.50 24 羟基伐地 那非 Hydroxyvardenafil 224785-98-2 C23H32N，0S 5.344 M+H+ 505.22277 505.22319 0.84 25 羟基豪莫西 地那非 Hydroxyho- mosildenafi 139755-85-4 lC23H32N，0，S 5.731 [M+H]+ 505.222775 505.22307 0.60 26 乌地那非 Udenafil 268203-93-6 C25H36N，O4S 7.015 M+H]+ 517.25915 517.25939 0.46 27 羟基硫代豪 莫西地那非 Hydroxythioho- mosildenafil 479073-82-0 C23H32N，04S2 11.893 [M+H]+ 521.19992. 5 521.20022 0.57 28 那莫伐地 那非 Norneovardenafil 358390-39-3 C18H20N404 11.230 [M+H]+ 357.15573 357.15572 -0.03 29 硝地那非 Nitrodenafil 147676-99-1 C17H19N504 17.917 [M+H]+ 358.15098 358.15112 0.39 30 去甲基他达 拉非 Nortadalafil 171596-36-4 C21H17N04 8.825 [M+H]+ 376.12918 376.12889 -0.78 31 氯地那非 Chlorodenafil 1058653-74-9 C19H2CIN403 17.019 [M+H]+ 389.13750 389.13764 0.37 32 羟基氯地 那非 Hydroxychlorode- nafil 1391054-00-4 C19H23CIN403 15.810 [M+H]+ 391.15315 391.15321 0.17 33 N-丁基他达 拉非 N-Butyltadalafil 171596-31-9 C25H25N304 17.406 [M+H]+ 432.19178 432.19172 -0.15 34 去甲基卡巴 地那非 Desmethylcar- bodenafil 147676-79-7 C23H30N603 4.314 [M+H]+ 439.24522 439.24540 0.42 35 去炭西地 那非 Descarbonsilde- nafil 1393816-99-3 C21H30N，04S 5.234 M+H]+ 463.21220 463.21251 0.67 36 二甲基红地也 那非 Dimethylacetilde- nafil 11290041-88-1 C25H34N，03 6.242 [M+H]+ 467.27652 467.27681 0.63 37 二硫代去甲 基卡巴地 那非 Dithio-desmethyl- carbodenafil 1333233-46-7 C23H30N，OSz 12.925 [M+H]+ 471.19953 471.19976 0.49 38 酮红地那非 Oxohongdenafil 1446144-70-2 C25H32N，04 10.303 [M+H]+ 42 环戊那非 Cyclopentynafil 1173706-34-7 C26H36N04S 6.002 [M+H]+ 529.25915 529.25961 0.87 丙氧苯基硫 Propoxyphenyl 43 代羟基豪莫 thiohydroxyho-D- mosildenafil 479073-90-0 C24H34N604S2 14.444 M+H+ 535.21557 535.21591 0.63 西地那非 44 苄西地那非 Benzylsildenafil 1446089-82-2 C28H34N04S 9.644 [M+H]+ 551.24350 551.24386 0.65 45 桂地那非 Cinnamyldenafil 1446089-83-3 C32H38N603 10.834 [M+H]+ 555.30782 555.30810 0.51 46 罗地那非碳 酸酯 Lodenafil carbonate 398507-55-6 )(C47H62N120nS217.800 M+2H]2+ 518.21230 518.21313 1.60 47 丙氧苯基西 地那非 Propoxyphenyl- sildenafil 877777-10-1 C23H32N604S 7.190 [M+H]+ 489.22785 489.22805 0.41 48 脱哌嗪基硫 代西地那非 Depiperazinothi- osildenafil 1353018-10-66CC17H20N404S2 12.843 [M+H]+ 409.09987 409.09998 0.26 49 乙酰胺基他 达拉非 Acetaminotada- lafil 1446144-71-3 C23H20N40， 8.460 [M+H]+ 433.15065 433.15056 -0.20 50 2-羟丙基去 甲他达拉非 去卡 2 2-Hydroxypropyl- nortadalafiliL 1353020-85-5 C24H23N305 10.745 [M+H]+ 434.17105 434.17087 -0.41 51 乙酰伐地 那非 Acetylvardenafil 1261351-28-3 C25H34N，0： 4.611 [M+H]+ 467.27652 467.27674 0.48 丙氧苯基羟 52 基豪莫西地 那非 Propoxyphenyl hydroxyho- mosildenafil 139755-87-6 C24H34N60，S 7.328 [M+H]+ 519.23842 519.23864 0.43 53 丙氧苯基硫 代艾地那非 Propoxyphenyl thioaildenafil 856190-49-3 C24H34N603S 15.207 [M+H]+ 519.22066 519.22091 0.49 54 育亨宾 Yohimbine 146-48-5 C21H26N203 3.136 [M+H]+ 355.20162 3355.20155 -0.19 55 达泊西汀 Dapoxetine 119356-77-3 CH2NO 7.702 [M+H]+ 306.18524 306.18518 -0.20 N-去乙基红 N-Desethylacetil- 56 147676-55-9地那非 denafil C23H30N60： 5.185 [M+H]+ 439.24522 439.24547 0.58 57 去甲基硫代 西地那非 Desmethylthi- osildenafil 479073-86-4 C21H28N603S2 12.105 [M+H]+ 477.17371 477.17395 0.51 58 N-叔丁氧羰灰 基-N-去乙基 N-Boc-N-desethyl acetildenafil 1246820-46-1 C28H38N605 10.604 [M+H]+ 539.29765 539.29797 0.60 红地那非 59 N-乙基他达 拉非 N-Ethyltadalafil 1609405-34-6 C23H21N304 12.056 [M+H]+ 404.16048 404.16024 -0.60 60 O-去乙基西 地那非 O-Desethylsilde- nafil 139755-91-2 C20H26N，04S 7.363 [M+H]+ 447.18090 447.18106 0.36 61 吡唑N-去甲 基西地那非 Pyrazole N-desmethyl- sildenafil 139755-95-6 C21H28N，04S 3.933 M+H+ 461.19655 461.19676 0.45 62 异丁基西地 那非 Isobutylsildenafil il 1391053-95-4 C23H32N，O4S 7.190 [M+H]+ 489.2278535 489.22805 0.41 西地那非二 = Sildenafil dimer 65 西地那非N- 氧化物 Sildenafil N-oxide 1094598-75-0 C22H30N，OsS 6.383 M+H+ 491.20712 491.2076 0.99 66 伐地那非N- 氧化物 VardenafilN- oxide 448184-48-3 C23H32N6OgS 5.869 [M+H]+ 505.22277 505.22307 0.60 67 2-羟乙基去 甲他达拉非 2-Hydroxyethyl- nortadalafil 385769-94-8 C23H21N305 8.932 [M+H]+ 420.155404420.15541 0.03 68 伐地那非乙 酰基类似物 Vardenafil acetyl analogue / C24H31N，03 4.547 [M+H]+ 438.24997 438.25009 0.28 69 伐地那非二 聚体 Vardenafil dimer 1： 1255919-03-9 C38H46N10OgSz 18.654 M+H+ 835.30143 835.30272 1.55 70 米罗那非 Mirodenafil 862189-95-5 C26H37N，O，S 10.224 [M+H]+ 532.25882 532.25912 0.57 71 亚硝地那非 Mutaprodenafil 1387577-30-1 C27H35Ng0，S； 8.981 [M+H]+ 630.22751 630.22804 0.84 72 硫喹哌非 Thioquinapiperfil 220060-39-9 C24H28N，OS 6.265 [M+H]+ 449.2118l 449.21196 0.34 73 氨基西地 那非 Aminosildenafil 319491-68-4 C18H23N，O4S 10.517 M+H]+ 406.15435 406.15447 0.29 74 去乙基卡巴L 地那非 Desethylcarbode- nafil 11027192-92-2 C22H28N603 4.384 M+H]+ 425.22957 425.22968 0.27 75 双去碳西地也 那非 Didescarbonsilde- nafil 466684-88-8 C20H28N6O4S 5.177 M+H]+ 449.19655 449.19682 0.60 76 N-苯丙烯基 他达拉非 N-Phenylpropen- yltadalafil 2064212-00-4 C30H24N404 18.654 [M+H]+ 505.18703)3 505.18754 1.01 N-去乙基- N-Deseth- 77 N-甲基伐地 yl-N-methylvarde-2 那非 nafil 224785-87-9 C22H30N，04S 5.318 [M+H]+ 475.21220 475.21244 0.50 78 硫代艾地 那非 Thioaildenafil 856190-47-1 C23H32N603S2 12.880 [M+H]+ 505.20501 505.20528 0.54 79 双氯地那非 Dichlorodenafil 1446089-84-4 C19H20CI2N402 19.876 [M+H]+ 407.10361 407.10436 1.85 80 哌唑那非 Piperazonifil 1335201-04-1 C25H34N，04 6.049 [M+H]+ 483.27143 483.27168 0.52 81 丙氧苯基硫 代西地那非 Propoxyphenyl thiosildenafil 479073-87-5 C23H32N60Sz 14.205 [M+H]+ 505.20501 505.20525 0.48 82 丙氧苯基硫 代豪莫西地 那非 Propoxyphenyl thiohomosilde- nafil 479073-88-6 C24H34N603Sz 14.343 M+H]+ 519.22066 519.22084 0.35 83 二硫代去乙 基卡巴地 那非 Dithiodesethyl carbodenafil 1610830-81-3 C22H28N，OS2 12.760 [M+H]+ 457.18388 457.18398 0.23 84 羟基硫代红 地那非 Hydroxythioace- tildenafil 1159977-47-5 C25H34N6O3S 11.055 [M+H]+ 499.24859 499.24881 0.45 85 他达拉非二 氯代杂质 Tadalafil dichloro impurity 1598416-08-0C22H18CI2N205 16.600 [M+H]+ 461.06655 461.06601 -1.18 86 西地那非杂质 12 Sildenafil impurity 12 C25H34N，OS， 13.966 M+H+ 499.23083 499.23112 0.58 去甲基哌嗪 — 88 丙氧苯基艾 地那非 Propoxyphenyl aildenafil 1391053-82-9 C24H34N，04S 8.039 [M+H]+ 503.24350 503.24371 0.42 89 西地那非杂质 14 Sildenafil impurity 14 2146091-79-2 C24H32N，OSz 14.224 M+H+ 485.21518 485.21536 0.38 90 丙氧苯基异 丁基艾地 那非 Propoxyphenyli- sobutyl aildenafil 1621873-33-3 C25H36N，O4S 9.660 M+H+ 517.25915 517.25938 0.44 2.4抗疲劳饮料样品分析 2.4.1一级质谱质量数准确度和同位素丰度匹配度评价 按照前述分析条件分析抗疲劳饮料样品，利用岛津LabSolutions Insight Explore中分子式预测功能，基于一级质谱准确质量数和同位素丰度比匹配度进行定性筛查。使用该软件计算其同位素丰度匹配得分，设定定差范围5 ppm， 设定元素组成为C、H、O、N、S。图2为西地那非一级质谱提取离子流图，可见图中有一明显的色谱峰，其保留时间与西地那非标准品一致。图3为一级质谱准确质量数相对误差和同位素丰度比与理论值的匹配得分。结果表明，软件预测得到的分子式中排名第一的是 C22H30N6O4S，一级质谱质量数相对误差为 0.44 ppm， 检索得分为97.55分，同位素丰度匹配得分为97.47，故判定该化合物为西地那非。 1：475.2122+/-5.0ppm(+) 6.87e4 RT (min) 图2西地那非的一级提取离子流图 图3西地那非同位素分布评价结果 2.4.2二级质谱库搜索匹配评价 在 LabSolutions 软件中使用MSn 谱库搜索功能，，调用已创建的90种那非类化合物筛查二级质谱库， 设置相应的搜索参数，.5可对抗疲劳饮料样品中的筛查结果做进一步确认。图4为抗疲劳饮料样品中筛查出的化合物西地那非的二级质谱搜库结果。由搜库结果可知，西地那非的实测二级质谱图与谱库中碰撞能量(CE) 在35V下采集到的二级质谱信息搜索匹配相似度为94%。 图4西地那非二级质谱库搜索结果 结论 本文采用岛津公司 LCMS-9030 超高效液相色谱四飞杆飞行时间质谱联用仪，建立了对抗疲劳饮料中90种那非类物质定性筛查的方法，同时创建了二级质谱库。方法检出限为0.003~0.490 mg/L，灵敏度高。一级质谱质量数准确度误差小于2.0 ppm， 同位素分布真实准确，二级质谱库匹配度好。该方法简便、灵敏、定性筛查准确性好，适用于抗疲劳饮料中90种那非类化合物的快速定性筛查。 岛津应用云 本文利用岛津LCMS-9030超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪，建立了定性筛查抗疲劳饮料中90种那非类物质的方法。结合保留时间、一级质谱准确质量数和同位素丰度评价信息实现90种那非类化合物的快速定性筛查。一级质谱准确质量数相对误差均小于2.0 ppm，优于定性的一般要求（小于5 ppm）。建立了90种那非类化合物的二级质谱库，使用二级质谱库搜索匹配评价功能可进行进一步的确证。使用抗疲劳饮料加标样品考察方法检出限，90种那非类物质方法检出限在0.003~0.490 mg/L之间。使用该方法测试了抗疲劳饮料样品，检出西地那非，其一级质谱质量数相对误差为0.44 ppm，检索得分为97.55分，同位素丰度匹配得分为97.47，二级质谱信息搜索匹配相似度为94%。该方法简便、灵敏、定性筛查准确性好，适用于抗疲劳饮料中90种那非类化合物的快速定性筛查。