噻嗪类强极性碱性化合物中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

SepaFlash® HILIC ARG柱应用于噻嗪类强极性化合物的分离纯化 应用技术研究中心 背景介绍 噻嗪类（Thiazide）是一类含有氮和硫元素的杂环分子，属于利尿剂类药物，常用于治疗高血压和水肿（如心力衰竭、肝功能衰竭或肾功能衰竭等引起）。噻嗪类利尿剂降低了因高血压引起的死亡、中风、心脏病及心力衰竭的风险[1]。噻嗪类于20世纪50年代由默克公司首先发现并进行药物研发，第一个噻嗪类药物——氯噻嗪在1958年上市，并以商品名Diuril进行销售[2]。在大多数国家，噻嗪类药物是最便宜的抗高血压药物[3]。噻嗪类药物长期降低血压的作用机制尚不完全清楚。当急性给药时，噻嗪类通过引起利尿、血浆量下降和心输出量降低来降低血压。然而，经长期用药后，噻嗪类通过降低外周阻力（即血管舒张）引起血压降低[4,5]。尽管噻嗪类药物毒性较低，但是用药过量或长期用药仍然可能引起剂量依赖性的药理性不良反应，包括离子紊乱、高尿酸血症、高血糖症等。 在本应用案例中，样品分子结构中含有噻嗪类母体结构，普通正相硅胶柱或反相C18 柱均不适合对其进行分离纯化，三泰科技的应用工程师利用SepaFlash® HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean® machine成功对其进行了分离，获得了满足纯度要求的目标产物，为此类样品的分离纯化提供了便捷高效的解决方案。 实验部分 本文中待纯化的样品来自某制药公司，为含有噻嗪类母体结构的碱性化合物，极性较大，但在甲醇、水等常用溶剂中溶解度低，粗品纯度约为81%（HPLC分析结果），其分子结构式示意图参见图1。 图1. 噻嗪类样品分子结构式示意图。 由于样品分子极性较大，在常用正相溶剂中溶解度很低，因此正相分离模式首先被排除。接下来考虑采用反相C18分离柱对其进行分离纯化。为提高样品在水中的溶解度，在样品中加入少量三氟乙酸（TFA）使样品成盐后溶于水中。取适量样品溶液利用注射器上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 表1. Flash制备纯化实验参数设置 仪器 SepaBean® machine T 色谱柱 12 g SepaFlash® C18反相分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP) 120 g SepaFlash® HILIC ARG分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5622-120-SP) 检测波长 220 nm, 254 nm 流动相 溶剂A：水 (添加0.1%TFA) 溶剂B：乙腈 (添加0.1%TFA) 流速 15 mL/min 50 mL/min 进样量 100 mg 500 mg 洗脱梯度 时间 (min) 溶剂B (%) 时间 (min) 溶剂B (%) 0 10 0 70 10.0 90 35.0 0 结果与讨论 样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，由于样品极性较大，样品在普通C18反相柱上基本没有保留，随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来，未能获得有效的纯化。 图2. 样品在C18反相柱上的Flash制备图谱。 众所周知，亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）采用强亲水性的极性固定相，在洗脱过程中流动相中水相比例逐步提高，适合于极性较大的样品的分离纯化。因此，后续考虑采用亲水作用模式对样品进行分离纯化。三泰科技推出的SepaFlash® HILIC ARG分离柱，其填料表面键合有极性很强的Arg基团（参见图3），可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱如图4所示。分析图4可知，样品在HILIC分离模式下，在分离柱固定相上获得了较好的保留，且粗品中的其他杂质也得到了有效的分离。将收集组分经冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度约为95.3%（参见图5），可用于下一步的研究开发。 图3. SepaFlash HILIC ARG分离柱填料表面键合相示意图。 图4. 样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱。 图5. 目标产物的HPLC分析图谱。 因此，对于噻嗪类强极性化合物的制备纯化，SepaFlash® HILIC ARG分离柱配合SepaBean® machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。 关于SepaFlash® HILIC ARG分离柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash® HILIC ARG分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。 表2. SepaFlash® HILIC ARG分离柱参数 （填料:High-efficiency spherical ARG, 20 – 45 μm, 100 Å） Item Number Column Size Sample Size Max.Pressure (psi/bar) SW-5622-004-SP 5.4 g 5.4 mg – 108 mg 400/27.5 SW-5622-012-SP 20 g 20 mg – 0.40 g 400/27.5 SW-5622-025-SP 33 g 33g – 0.66 g 400/27.5 SW-5622-040-SP 48 g 48 mg – 0.96 g 400/27.5 SW-5622-080-SP 105 g 105 mg – 2.1 g 350/24.0 SW-5622-120-SP 155 g 155 mg – 3.1 g 300/20.7 SW-5622-220-SP 300 g 300 mg – 6.0 g 300/20.7 SW-5622-330-SP 420 g 420 mg – 8.4 g 250/17.2 如需进一步了解SepaBean® machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问CBG在线商店：https://store.chembeango.com/。 参考文献 Wright JM, Musini VM (July 2009). Wright, James M, ed. "First-line drugs for hypertension". Cochrane Database Syst Rev. 8 (3): CD001841. Beyer KH (1993). "Chlorothiazide. How the thiazides evolved as antihypertensive therapy" (PDF). Hypertension. 22 (3): 388–91. Whitworth JA, World Health Organization, International Society of Hypertension Writing Group (November 2003). "2003 World Health Organization (WHO)/International Society of Hypertension (ISH) statement on management of hypertension" (PDF). J Hypertens. 21 (11): 1983–92. Hughes AD (2004). "How do thiazide and thiazide-like diuretics lower blood pressure?". J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 5 (4): 155–60. Zhu Z, Zhu S, Liu D, Cao T, Wang L, Tepel M (2005). "Thiazide-like diuretics attenuate agonist-induced vasoconstriction by calcium desensitisation linked to Rho kinase". Hypertension. 45 (2): 233–9. 实验部分本文中待纯化的样品来自某制药公司，为含有噻嗪类母体结构的碱性化合物，极性较大，但在甲醇、水等常用溶剂中溶解度低，粗品纯度约为81%（HPLC分析结果），其分子结构式示意图参见图1。 图1. 噻嗪类样品分子结构式示意图。由于样品分子极性较大，在常用正相溶剂中溶解度很低，因此正相分离模式首先被排除。接下来考虑采用反相C18分离柱对其进行分离纯化。为提高样品在水中的溶解度，在样品中加入少量三氟乙酸（TFA）使样品成盐后溶于水中。取适量样品溶液利用注射器上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean® machine T色谱柱12 g SepaFlash® C18反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP)120 g SepaFlash® HILIC ARG分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5622-120-SP)检测波长220 nm, 254 nm流动相溶剂A：水 (添加0.1%TFA)溶剂B：乙腈 (添加0.1%TFA)流速 15 mL/min50 mL/min进样量100 mg500 mg洗脱梯度时间 (min)溶剂B (%)时间 (min)溶剂B (%)01007010.09035.00结果与讨论样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知，由于样品极性较大，样品在普通C18反相柱上基本没有保留，随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来，未能获得有效的纯化。 图2. 样品在C18反相柱上的Flash制备图谱。众所周知，亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）采用强亲水性的极性固定相，在洗脱过程中流动相中水相比例逐步提高，适合于极性较大的样品的分离纯化。因此，后续考虑采用亲水作用模式对样品进行分离纯化。三泰科技推出的SepaFlash® HILIC ARG分离柱，其填料表面键合有极性很强的Arg基团（参见图3），可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱如图4所示。分析图4可知，样品在HILIC分离模式下，在分离柱固定相上获得了较好的保留，且粗品中的其他杂质也得到了有效的分离。将收集组分经冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度约为95.3%（参见图5），可用于下一步的研究开发。 图3. SepaFlash HILIC ARG分离柱填料表面键合相示意图。 图4. 样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱。 图5. 目标产物的HPLC分析图谱。因此，对于噻嗪类强极性化合物的制备纯化，SepaFlash® HILIC ARG分离柱配合SepaBean® machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。