合成药物中间体中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

正交色谱分离模式应用于合成药物中间体的分离纯化 应用技术研究中心 简介 正相色谱和反相色谱是Flash制备色谱常用的两种分离模式，被广泛应用于各类有机合成产物的分离纯化中。在正相色谱中，采用极性固定相（如带有二醇基、氨基或氰基的固定相及硅胶、三氧化二铝等）并结合使用非极性流动相（如正己烷等），根据分子的极性大小将其分开。由于正相色谱以吸附效应作为分离的基础，因此也被称为吸附色谱。而在反相色谱中，采用非极性固定相（如带有C18基团的硅胶等）配合极性流动相对样品进行分离。这两种分离模式基于不同的分离机理，因此在将两种分离模式联用时可称之为正交色谱分离模式，从而获得对复杂样品更高的分辨力和更好的分离效果。本文中以某合成药物中间体为样品，利用SepaFlash系列正相硅胶柱及反相C18柱联合使用，实现了对样品的高效分离纯化，获得了满足纯度要求的目标产物，为此类复杂样品的快速制备纯化提供了新的思路。 实验部分 样品来自某新药研究公司，首先取微量样品溶于甲醇后进行HPLC纯度分析，参考如图1所示的粗品HPLC分析图谱，可知粗品纯度约为66%，其中有1个杂质成分其保留时间与目标产物非常接近，给后续的分离纯化提出了较高的要求。 图1. 粗品的HPLC分析图谱。 由于样品的极性较大，因此首先考虑采用普通正相硅胶柱对其进行分离纯化。取3 g样品溶于甲醇后，再以6 g硅胶（规格与Flash制备实验中所用硅胶柱填料相同）拌样，利用旋蒸仪除去溶剂后，固体上样至一根与Flash分离柱联用的iLOK®空柱中，Flash制备实验参数如表1所示。正相分离模式的Flash分离图谱如图2所示。 表1. 正相制备纯化实验参数设置。 仪器 SepaBean® machine T 色谱柱 80 g SepaFlash® Standard Series正相分离柱 (不定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号: S-5101-0080) 检测波长 220 nm；254 nm 流动相 乙酸乙酯 流速 50 mL/min 进样量 3 g粗品 洗脱梯度 100%等度洗脱 图2. 粗品在正相硅胶柱上的Flash制备图谱。 图3. 粗品经正相硅胶柱分离后收集组分的HPLC分析图谱。 取收集组分进行HPLC分析（如图3所示），结果表明：收集组分的纯度约为92%，与要求的95%以上纯度尚有一定差距。分析图3可知，与目标物具有近似保留时间的杂质未能与目标产物分离开。考虑到反相色谱模式与正相色谱模式的正交性，可以提供额外的分辨力，因此我们对正相分离的收集组分进行旋蒸处理去除溶剂后，取300 mg样品溶于2.5 mL甲醇中，并适当滴加DMSO使其完全溶解，然后采用液体进样的方式利用注射器上样至C18反相分离柱，Flash制备实验参数如表2所示。反相分离模式的Flash分离图谱如图4所示。 表2. 反相制备纯化实验参数设置。 仪器 SepaBean® machine T 色谱柱 120g SepaFlash® Bonded Series C18反相分离柱 (球型硅胶, 20 - 45 μm, 100Å, 订货号: SW-5222-120-SP) 检测波长 220 nm；254 nm 流动相 溶剂A：水； 溶剂B：甲醇 流速 30 mL/min 进样量 2.5 mL (300 mg) 洗脱梯度 时间 (CV) 溶剂B (%) 0 60 8 80 12 80 12.5 100 13.5 100 图4. 正相硅胶柱分离后收集组分在C18反相柱上的Flash制备图谱。 取收集组分进行HPLC分析，结果表明：收集组分的纯度约为98%，满足制备要求，可以用于客户的进一步研究和开发中。 结论 本案例表明，结合正相色谱与反相色谱，可以有效地提高Flash制备过程的分辨力，尤其适合于一些复杂样品的分离纯化，完成普通单一模式的正相色谱或反相色谱无法完成的制备任务。同时，与制备级HPLC相比，Flash制备色谱在色谱柱成本方面具有极大的优势，不失为广大研究人员经济高效的纯化解决方案。 关于SepaFlash® 正相硅胶柱和C18反相柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash® Standard Series正相硅胶柱和SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列产品具有多种规格（参见表3和表4）。 表3. SepaFlash® Standard Series正相分离柱参数 Item Number Column Size Sample Size Flow Rate (mL/min) Max.Pressure (psi/bar) S-5101-0004 4 g 4 mg - 0.4 g 15-40 300/20.7 S-5101-0012 12 g 12 mg - 1.2 g 30-60 300/20.7 S-5101-0025 25 g 25 mg - 2.5 g 30-60 300/20.7 S-5101-0040 40 g 40 mg - 4.0 g 40-70 300/20.7 S-5101-0080 80 g 80 mg - 8.0 g 50-100 200/13.8 S-5101-0120 120 g 120 mg - 12 g 60-150 200/13.8 S-5101-0220 220 g 220 mg - 22 g 80-220 150/10.3 S-5101-0330 330 g 330 mg - 33 g 80-220 150/10.3 S-5101-0800 800 g 800 mg - 80 g 100-300 100/6.9 S-5101-1600 1600 g 1.6 g - 160 g 200-500 100/6.9 S-5101-3000 3000 g 3.0 g - 300 g 200-500 100/6.9 （填料：UltraPure irreugular silica, 40 - 63 μm, 60 Å） 表4. SepaFlash® C18系列反相柱参数 （填料：High-efficiency spherical C18, 20 - 45 μm, 100 Å） Item Number Column Size Sample Size Flow Rate (mL/min) Max.Pressure (psi/bar) SW-5222-004-SP 5.4 g 5.4 mg - 108 mg 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP 20 g 20 mg - 0.40 g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP 33 g 33 mg - 0.66 g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP 48 g 48 mg - 0.96 g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP 105 g 105 mg - 2.1 g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP 155 g 155 mg - 3.1 g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP 300 g 300 mg - 6.0 g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP 420 g 420 mg - 8.4 g 40-80 250/17.2 如需进一步了解SepaBean® machine 系列产品的详细规格信息，或配套使用的SepaFlash®各系列快速分离柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。 实验部分样品来自某新药研究公司，首先取微量样品溶于甲醇后进行HPLC纯度分析，参考如图1所示的粗品HPLC分析图谱，可知粗品纯度约为66%，其中有1个杂质成分其保留时间与目标产物非常接近，给后续的分离纯化提出了较高的要求。图1. 粗品的HPLC分析图谱。由于样品的极性较大，因此首先考虑采用普通正相硅胶柱对其进行分离纯化。取3 g样品溶于甲醇后，再以6 g硅胶（规格与Flash制备实验中所用硅胶柱填料相同）拌样，利用旋蒸仪除去溶剂后，固体上样至一根与Flash分离柱联用的iLOK®空柱中，Flash制备实验参数如表1所示。正相分离模式的Flash分离图谱如图2所示。表1. 正相制备纯化实验参数设置。仪器SepaBean® machine T色谱柱80 g SepaFlash® Standard Series正相分离柱(不定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号: S-5101-0080)检测波长220 nm；254 nm流动相乙酸乙酯流速 50 mL/min进样量3 g粗品洗脱梯度100%等度洗脱图2. 粗品在正相硅胶柱上的Flash制备图谱。图3. 粗品经正相硅胶柱分离后收集组分的HPLC分析图谱。取收集组分进行HPLC分析（如图3所示），结果表明：收集组分的纯度约为92%，与要求的95%以上纯度尚有一定差距。分析图3可知，与目标物具有近似保留时间的杂质未能与目标产物分离开。考虑到反相色谱模式与正相色谱模式的正交性，可以提供额外的分辨力，因此我们对正相分离的收集组分进行旋蒸处理去除溶剂后，取300 mg样品溶于2.5 mL甲醇中，并适当滴加DMSO使其完全溶解，然后采用液体进样的方式利用注射器上样至C18反相分离柱，Flash制备实验参数如表2所示。反相分离模式的Flash分离图谱如图4所示。表2. 反相制备纯化实验参数设置。仪器SepaBean® machine T色谱柱120g SepaFlash® Bonded Series C18反相分离柱(球型硅胶, 20 - 45 μm, 100Å, 订货号: SW-5222-120-SP)检测波长220 nm；254 nm流动相溶剂A：水；溶剂B：甲醇流速 30 mL/min进样量2.5 mL (300 mg)洗脱梯度时间 (CV)溶剂B (%)060880128012.510013.5100图4. 正相硅胶柱分离后收集组分在C18反相柱上的Flash制备图谱。取收集组分进行HPLC分析，结果表明：收集组分的纯度约为98%，满足制备要求，可以用于客户的进一步研究和开发中。结论   本案例表明，结合正相色谱与反相色谱，可以有效地提高Flash制备过程的分辨力，尤其适合于一些复杂样品的分离纯化，完成普通单一模式的正相色谱或反相色谱无法完成的制备任务。同时，与制备级HPLC相比，Flash制备色谱在色谱柱成本方面具有极大的优势，不失为广大研究人员经济高效的纯化解决方案。关于SepaFlash® 正相硅胶柱和C18反相柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash® Standard Series正相硅胶柱和SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列产品具有多种规格（参见表3和表4）。表3. SepaFlash® Standard Series正相分离柱参数  Item NumberColumn SizeSample SizeFlow Rate(mL/min)Max.Pressure(psi/bar)S-5101-00044 g4 mg - 0.4 g15-40300/20.7S-5101-001212 g12 mg - 1.2 g30-60300/20.7S-5101-002525 g25 mg - 2.5 g30-60300/20.7S-5101-004040 g40 mg - 4.0 g40-70300/20.7S-5101-008080 g80 mg - 8.0 g50-100200/13.8S-5101-0120120 g120 mg - 12 g60-150200/13.8S-5101-0220220 g220 mg - 22 g80-220150/10.3S-5101-0330330 g330 mg - 33 g80-220150/10.3S-5101-0800800 g800 mg - 80 g100-300100/6.9S-5101-16001600 g1.6 g - 160 g200-500100/6.9S-5101-30003000 g3.0 g - 300 g200-500100/6.9