红豆杉提取物中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

SepaBean@ machine 应用于红豆杉提取物SANTAITECHNOLOGIES的分离纯化作者：应用技术研究中心 应用文章 AN017 1简介 红豆杉是国家重点保护的野生植物，是第四纪冰川后遗留下的珍稀濒危植物，也是全球唯一自然药用植物。红豆杉分布于北半球温带至中亚热带地区，全世界约有11种。我国有其中的4种及1个变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、红豆杉、西藏红豆杉及南方红豆杉，这5种在我国西南、华南、华中、华东、西北、东北以及台湾地区均有分布。红豆杉属植物含有的化学成分类型多样，主要包括紫杉烷类、黄酮类、木脂素类、甾体类、酚酸类、倍半萜及糖苷类化合物等，其中，著名的抗肿瘤药物——紫杉醇(Taxol或Paclitaxel)即属于紫杉烷类化合物。紫杉醇具有独特的抗癌机理：与微管结合，"冻结”住它们，在细胞分裂之时阻止微管分离染色体，从而导致分裂细胞尤其是快速增殖的癌细胞死亡[1]；通过激活巨噬细胞，导致肿瘤坏死因子(TNF-α)受体的减少及TNF-α的释放，杀伤或抑制肿瘤细胞[2]；作用于细胞凋亡受体途径的Fas/Fasl通路，或激活半胱氨酸蛋白酶系统，诱导细胞凋亡[3]。因其广谱的抗癌作用，紫杉醇被广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤和头颈部肿瘤等的治疗[4]，尤其是对晚期乳腺癌和晚期卵巢癌具有突出的疗效，被称为"治疗癌症的最后一道防线”。 紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。近年来随着人口和癌症发病率呈爆发性增长，对紫杉醇的需求量亦明显增大。目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取，由于紫杉醇在植物体中的含量相当低(目前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0.069%)，大约13.6kg的树皮才能提出1g的紫杉醇，治疗一个卵巢癌患者需要3-12棵百年以上的红豆杉树，也因此造成了对红豆杉的大量砍伐，致使这种珍贵树种已濒临灭绝。加之红豆杉属植物本身资源很贫乏，生长缓慢，这对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。 目前，紫杉醇的全合成已获得成功，但其合成路线复杂，成本昂贵，不具有产业意义。现在紫杉醇的半合成方法已比较成熟，被认为是除人工种植外，扩大紫杉醇来源的有效途径。紫杉醇的半合成法是通过在红豆杉植物中提取出含量较高的紫杉醇前体化合物，然后通过化学合成的方法将其转化为紫杉醇。其中，10-脱酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatin Ⅲ)在欧洲红豆杉针叶中含量可达0.1%，且针叶易再生，因此以10-脱酰基巴卡亭III为原料半合成紫杉醇是目前非常热门的一个研发方向[5](参见见1)。 【图1.以10-脱酰基巴卡亭III为原料半合成紫杉醇的合成路线】 在本文中，三泰科技的研发人员利用快速液相制备色谱系统SepaBean@machine配合SepaFlash@C18反相分离柱对红豆杉植物提取物进行了分离纯化，获得了满足制备需求的目标产品，可用于后续的进一步科学研究中，为此类天然产物的快速制备纯化提供了经济高效的解决方案。 I实验部分 样品来自某大学天然产物研究实验室，为红豆杉植物提取物，将红豆杉树皮用乙醇萃取后得到粗品，然后将粗提物溶于DMSO并作为样品在Flash制备色谱系统上进样， Flash制备实验参数如表1所示。 【表1.制备纯化实验参数设置】 仪器 SepaBeanmachine 色谱柱 12 gSepaFlashBonded Series C18反相分离柱(球形硅胶， 20-45 um， 100A 订货号： SW-5222-012-SP) 检测波长 254 nm； 280 nm 流动相 溶剂A：水； 溶剂B：甲醇 流速 15my/min 进样量 20mg植物粗提物溶于1mL DMSO中 洗脱梯度 时间 (min) 溶剂 B (%) 0 10 5 10 7 28 14 28 16 40 20 60 27 60 30 72 40 43 72 100 45 100 |结果与讨论 红豆杉植物粗提物的Flash制备分离图谱如图2所示。分析色谱图可知，目标产物与杂质得到了基线分离，且重复多次进样后所得色谱图一致性很好(重复进样分离的数据未展示)。与传统的手工过柱方式相比(参见图3)，原来采用的手工过玻璃柱的方法耗时约为4 h， 而采用自动化方法则仅需要44 min ，可以节省80%以上的时间，以及大量的洗脱溶剂，从而有效降低成本，大大提高研究效率。 【图2.红豆杉植物粗提物的Flash制备分离图谱】 【图3.传统过柱方法与自动分离纯化方法的对比】 本实验结果表明： SepaFlash@ C18反相分离柱配合SepaBean@machine快速液相制备色谱系统，为红豆杉提取物这类天然产物的快速制备纯化提供了快捷高效的解决方案。 ( 参考文献 ) ( 1. Alushin GM， Lander G C， Kellogg EH， Zhang R， Baker Dand N ogales E . High-resolution microtubule structures reveal t he s tructural t ransitions in aB-tubulin upon G T P hydrolysis. Cell， 2014， 157(5)， 1117-1129. ) 2. Burkhart CA， Berman JW，Swindell CS and Horwitz SB.Relationship between the Structure of Taxol and OtherTaxanes on Induction of Tumor Necrosis Factor-a GeneExpression and Cytotoxicity. Cancer Research， 1994， 54 (22)，5779-5782. ( 3. P ark SJ， Wu CH， Gordon JD， Zhong X， Emami A and SafaAR. T axol Induces Caspase-10-dependent Apoptosis， J. Bio l . Chem.， 2004，279，51057-51067. ) ( 4. Pa clitaxel . The American Society of H e alth-System Pharmacists. [ January 2， 2015] ) 5. Bruce Ganem and Roland R. Franke. Paclitaxel fromPrimary Taxanes： A Perspective on Creative Invention inOrganozirconium Chemistry.J. Org. Chem.， 2007， 72 (11)，3981-3987. I关于SepaFlash@ C18反相柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash@ C18反相柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 【表2 SepaFlash@C18系列反相柱参数】 (填料：High-efficiency spherical C18，20-45 um，100A) Item Number Column Size Flow Rate Max Pressure (mL/min) (psi/bar) SW-5222-004-SP 5.4g 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP 20g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP 33g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP 48g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP 105g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP 155g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP 300g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP 420g 40-80 250/17.2 如需进一步了解SepaBean@machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问 ( 址：江苏省常州市新北区庆阳路78号 ) ( 机：0 5 19-85150175 ) ( 销售部：400-625-6069 ) ( 真：0 5 19-85153561 ) ( 传 网 址： w ww.santaitech.com ) ( 产品订购信箱： order@santaitech.com ) ( 销售部信箱：sal e s@santaitech.com技术支持信箱：support@santaitech.com ) ( 客户服务信箱： service@santaitech.com ) 实验部分样品来自某大学天然产物研究实验室，为红豆杉植物提取物，将红豆杉树皮用乙醇萃取后得到粗品，然后将粗提物溶于DMSO并作为样品在Flash制备色谱系统上进样，Flash制备实验参数如表1所示。表1. 制备纯化实验参数设置仪器SepaBean machine色谱柱12 g SepaFlash Bonded Series C18反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP)检测波长254 nm；280 nm流动相溶剂A：水；溶剂B：甲醇流速 15 mL/min进样量20 mg植物粗提物溶于1 mL DMSO中洗脱梯度时间 (min)溶剂B (%)0105107281428164020602760307240724310045100结果与讨论红豆杉植物粗提物的Flash制备分离图谱如图2所示。分析色谱图可知，目标产物与杂质得到了基线分离，且重复多次进样后所得色谱图一致性很好（重复进样分离的数据未展示）。与传统的手工过柱方式相比（参见图3），原来采用的手工过玻璃柱的方法耗时约为4 h，而采用自动化方法则仅需要44 min，可以节省80%以上的时间，以及大量的洗脱溶剂，从而有效降低成本，大大提高研究效率。 图2. 红豆杉植物粗提物的Flash制备分离图谱。 图3. 传统过柱方法与自动分离纯化方法的对比。本实验结果表明：SepaFlash C18反相分离柱配合SepaBean machine快速液相制备色谱系统，为红豆杉提取物这类天然产物的快速制备纯化提供了快捷高效的解决方案。