哈巴俄苷、隐丹参酮等中有效成分分析检测方案(液相色谱仪)

龙珍参刘晓达金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 引言 高效液相色谱已有近五十年的发展历史，期间色谱分离时间缩短了好几倍，使用的色谱填料粒度越来越小，如Accucore Vanquish UHPLC 色谱柱使用1.5微米粒径的表面多孔实心核增强技术的固定相。理论上色谱柱的最小塔板高度为2dp，受各种因素影响，实际的最小塔板高度约为3~3.5dp。最佳流动相线速度与填料粒径dp成反比关系，填料粒径越小，最佳线速度越高，最佳流速范围越宽，越适合快速分离分析，如配合使用系统压力脉动更低、检测器灵敏度更高的 Vanquish UHPLC， 可实现几十秒梯度时间的超快速分离。 在常规 HPLC分析中，为了获得较高的分离度，往往需要使用更长的色谱柱和分析时间，并且在一定程度上牺牲检测灵敏度(色谱峰随保留时间延长而展宽)。根据范氏曲线(如图1)“，当使用小粒径色谱固定相时，如将粒径为5 pm、柱长为L的色谱柱换成 1.7 pm 粒径相同长度的色谱柱，分离效率可增加3倍。这意味着可以使用粒径1.7 pm、柱长为1/3L的色谱柱获得粒径为5pm、柱长为L的色谱柱同样的柱效，从而极大的缩短分析时间。使用小粒径固定相可以提高分离效率、、节约分析时间和流动相，但使用小粒径固定相也将极大增加系统压力。从 Darcy公式可知，将粒径减小到1/3，系统压力将增加9倍(式1)。这对系统压力在400 bar 以下的常规液相来说，意味着除非使用较短的色谱柱，否则小粒径色谱柱将无法在普通 HPLC上使用，或者无法以正常流速使用 (最佳线速度所需压力超过 HPLC 压力上限)。 图1.不同粒径色谱固定相的范氏曲线 u：线速度；d：固定相粒径；中：柱阻抗因子；n：流动相粘度；L：柱长 超高效液相色谱 (UHPLC) 是 HPLC的发展方向， UHPLC 系统除提供更高的耐压能力(>1000 bar)外，还具有更小的梯度延迟体积和检测器池体积，以及更高的检测器采集 频率3.4。Vanquish 系统将高端 UHPLC 提升到了一个新的水平，带来技术指标上的全面提升，系统可以承受更高的压力、提供更好的热稳定性、优化的系统体积、实现更好的线性和更高的检测灵敏度。 从2004年开始， UHPLC 已用于制药.5、临床16.71和复杂样品8-101分析，一般使用3 cm 到 15 cm长的 UHPLC 色谱柱。现在 Vanquish UHPLC 系统上可串联使用两根 25 cm长、填充2.2 pm颗粒填料的色谱柱，特别适用于复杂样品的分离。本文通过峰容量、分离速度、进样精密度、泵精密度等指标来考察系统性能，同时从药物分析方面的应用来说明如何选择高效的分离系统。 测试条件 仪器 1. U3000液相色谱系统： 泵： LPG-3400SD 自动进样器： WPS-3000SL 柱温箱： TCC-3000SD 检测器： DAD-3000 2. Vanquish UHPLC 系统： 检测器： Vanquish Diode Array Detector 柱温箱： Vanquish Column Compartment 自动进样器：Vanquish Autosampler 泵： Vanquish Binary Pump 3.某品牌高端 UHPLC 液相色谱系统 色谱条件 色谱柱：Acclaim C18 柱(2.1x250 mm， 2.2 pm)用于液相系统性能考察； Acclaim PAII 柱(2.1x150 mm， 2.2 pm)用于银杏杏取液分析；大连化物所 SEC 柱(4.6x150 mm， 5 pm)用于蛋白样品分析。 柱温：30℃ 检测波长：210 nm，254 nm， 270 nm， 265 nm 样品前处理 (1)快速分析样品：哈巴俄苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮 IIA溶于30%丙酮水溶液； (2)复杂样品：银杏注射液； (3)生物样品：lgG，牛血清白蛋白，碳酸酐酶，溶菌酶，细胞色素C和尿嘧啶。 (1)液相系统性能考察 本节内容中，我们选择哈巴俄苷、隐丹参酮、丹参酮和丹参酮IIA作为分析物，测试和比较各液相系统性能。哈巴俄苷是玄参的重要活性成分，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹 参酮 IIA是丹参的重要活性组分。对这几种化合物的定量、定性分析有利于玄参和丹参两种药材的质量控制。 A.梯度延迟体积 图2为HPLC、Vanquish 和某品牌高端 UHPLC 系统的梯度延迟曲线。从梯度延迟曲线可知 HPLC、Vanquish 和某品牌高端 UHPLC 的梯度延迟体积依次为1203、242和475pL。与普通 HPLC 相比，某品牌高端 UHPLC 对泵体积和管路进井了优化，因此具有更小的梯度延迟体积。与某品牌高端UHPLC相比， Vanquish 系统做了进一步优化，在保证混合效果的前提下，具有更小的梯度延迟体积，可实现更快的梯度分离。 图2.普通 HPLC (LPG)、某品牌高端 UHPLC 和 Vanquish 的梯度延迟曲线和延迟体积 以 750 mm x0.18 mm 管线代替色谱柱； 流动相： A-0.1%丙酮水；B：水；流动相组成：0-5min，5%A；5-25 min，5%-95%A；25-30 min 95%A。 B.快速分离实验 图3比较了相同分析条件下(流动相组成、进样体积、检测波长和色谱柱)，某品牌高端 UHPLC 系统和 Vanquish系统对哈巴俄苷、隐丹丹酮、丹参酮I和丹参酮IIA的分离。将 Vanquish 用做分析系统时，流速为1 mL/min；受某品牌高端 UHPLC 系统耐压能力的限制，将其用做分析系统时，流速为 0.9 mL/min (>14000psi)。 如图2和表1所示， 由于 Vanquish 具有更小的梯度延迟体积并且可以承受更高的系统压力，可在更高流速下做样品分析， 因此 Vanquish 可以提供更快的分离速度。此外，快速梯度引起的 Vanquish 基线波动较低，因此用 Vanquish做快速分析时，隐丹参酮、丹参酮和丹参酮IIA具有更高的信号响应。由于 Vanquish 具有较小的柱外体积，并且可应用于更高的流速，小粒径固定相在高流速下塔板高度降低。因此，即使保留时间更短， Vanquish也能提供比某品牌高端 UHPLC 更好的分离效率。 图3.某品牌高端 UHPLC和 Vanquish 用于活性化合物的快速分析流动相条件：0-0.8 min，40%-45%乙腈， 0.8-1.0 min 45%-80%乙腈，1.0-3.0 min，80%-90%乙腈，其余为水。 某品牌高端 UHPLC 流速：0.9mL/min。 Vanquish 流速：1mL/min。 表1.四种分析物在某品牌高端 UHPLC 和 Vanquish 系统中的保留行为 化合物 保留时间(min) 信噪比(S/N) 塔板数 (Plates/column) Vanquish 某品牌高端UHPLC Vanquish 某品牌高端UHPLC Vanquish 某品牌高端UHPLC 哈巴俄苷 0.59 0.62 194.5 200 7233 5873 隐丹参酮 1.87 2.11 757.1 58.9 70237 61151 丹参酮 1.96 2.21 198.6 15 71275 58952 丹参酮IIA 2.13 2.41 717.1 54.1 70059 62882 C. 进样精密度 小体积进样是考察 UHPLC 的重要方法，表2为0.5pL进样体积下， Vanquish 和某品牌高端 UHPLC的进样精密度。某品牌高端 UHPLC 为以为哈巴俄苷提供较好的进样精密度，但受基线波动的影响，隐丹参酮、丹参酮|和丹参酮IIA的进样精密度明显低于哈巴俄苷。经过优化后的Vanquish， 不仅可以为哈巴俄苷提供更高的进样精密度，还可以为其它三种化合物提供更高的进样精密度 (RSD<1%)。 当进样精度较高时，可用同一浓度的样品，进不同体积获取线性曲线。从而减少准备样品的时间并避免样品配制过程中的操作误差。表3为进样体积从0.5-4pL条件下四种分析物的线性方程。从结果可知，四种分析物均可在 Vanquish 上获得较好的线性曲线。此结果进一步证明Vanquish 具有优良的进样精密度。 表2.0.5 pL进样体积下， Vanquish 和某品牌高端 UHPLC的进样精密度(n=6) 化合物 Vanquish 某品牌高端 UHPLC 哈巴俄苷 0.70% 1.01% 隐丹参酮 0.54% 3.12% 丹参酮I 0.99% 2.43% 丹参酮 IIA 0.42% 2.48% 表3.进样0.5-4uL获取四种化合物校正曲线 化合物名称 校正曲线 R2 哈巴俄苷 A=0.3917C-0.0274 0.9999 隐丹参酮 A=0.5991C-0.0357 1.0000 丹参酮I A=0.2000C-0.0114 0.9999 丹参酮IIA A=0.5698C-0.0427 1.0000 进样体积：0.5，1，2，3，4pl；相同体积进样3次，取平均值计算线性曲线。 D.保留时间重复性 保留时间是色谱定性分析的重要依据，直接影响定性分析的准确性。如表4所示，某品牌高端 UHPLC 可为待测的四种分析物提供较好的保留时间重复性 (RSD<0.17%)。Vanquish 可以提供比某品牌高端 UHPLC 更好的保留时间重复性(RSD<0.05%)。 表 4.Vanquish 和某品牌高端 UHPLC的保留时间 RSD 值(n=6) Vanquish 某品牌高端 UHPLC 哈巴俄苷 0.00% 0.11% 隐丹参酮 0.05% 0.14% 丹参酮| 0.05% 0.17% 丹参酮 IIA 0.04% 0.16% (2) Vanquish 系统在中药分离中的应用 银杏制品的质量控制，除对主要成分和已知活性成分定量分析以外，指纹图谱的比较也是一种重要的手段。图4是使用普通 HPLC (A) 和 Vanquish (B)获得的银杏提取物指纹图谱。从图中可以看到，在同样的样品和色谱条件下，使用 Vanquish 系统可检测到更多的色谱峰。更高的峰容量意味着更好的分离能力。例如，用 HPLC分析时，在6，7，11 min 处观察到的组分无法实现分离，呈现出一个个“包”，同样的方法、色谱柱和样品，用 Vanquish 分离时在4，6，8 min处将上述组分分离成一个个尖锐的色谱峰。又如，1号组分在 HPLC上呈现一个色谱峰，在Vanquish上分 出两个色谱峰；2和3号组分在 HPLC上呈现现两个共洗脱的肩峰，在 Vanquish 上为基线分离的两个色谱峰。综上可知， Vanquish 具有更小的梯度延迟体积和柱外死体积，提供强大的分离能力，可为中药等复杂样品获取指纹图谱信息提供更高的分辨率。 图4.普通 HPLC 和 Vanquish 为银杏提取物获取的指纹图谱 1流动相条件：0-25 min， 30%-85%乙腈，15%100mM乙酸铵 (pH5.36)； 2流动相条件：0-25min， 30%-85%乙腈，5%100mM 乙酸铵(pH5.36)。 (3) Vanquish UHPLC 在蛋白质分离中的应用 单抗等蛋白分子的分离需要使用高浓度盐溶液，尤其是 NaCl。普通的不锈钢系统不耐受高盐溶液(NaCl)且容易引起蛋白变性和死吸附。因此，蛋白的分离需要使用对蛋白吸附小，能耐受高浓度盐溶液和宽pH范围的生物兼容液相系统。Vanquish 是生物兼容的UHPLC， 不仅具有生物兼容的管路材质，还具有优化后的管路体积，为蛋白的分离提供较好方法开发空间。图5是以150 mM NaCl 溶液为洗脱液，体积排阻模式下不同分子量化合物的分离。图6是不同浓度 NaCl用于对 BSA 的体积排阻分离。以上结果显示Vanquish可以为生物样品的分离提供较好的峰形和流动相优化空间。 图5.不同分子的体积排阻分离。 流动相：100mM Na，HPO-NaH，PO，缓冲液， pH6.8，内含150mM NaCl；流速：0.2mL/min；紫外检测波长：210nm. 图6.不同浓度 NaCl 用于 BSA分离 流动相：100mM Na，HPO-NaH，PO，缓冲液， pH6.8， 内含不同浓度 NaCl； 流速： 0.2mL/min；紫外检测波长：210nm. 三、应用前景 Vanquish 具有较小的梯度延迟体积(242pl，实验数据)和最高的耐压能力(1500 bar， 22000 psi)， 可以实现其它 UHPLC 无法实现的快速梯度分析。 Vanquish 具有较小的柱外死体积，可提供比 HPLC 更高的峰容量，将为复杂样品指纹图谱分析提供极大的帮助。 Vanquish 具有较高的进样精密度，即使进样体积低至0.5pL，6针重复进样峰面积的 RSD 值小于1%。可可通过进样同一样品的不同体积获取线性曲线，可节约大量样品配制时间并减少样品配制带来的误差。 Vanquish 具有较高的流速精度和较好的流动相混合效果，即使在快速梯度分离中，也能表现出较好的保留时间重复性 (RSD <0.5%)，，较小的基线波动。因此， Vanquish 可提高化合物定性分析的准确性和定量分析的灵敏度。 综上所述， Vanquish 无论是在简单样品的快速分离中，还是复杂样品的指纹图谱分析中都具有优良的表现。 ( [1] Novakova L， Matysova L， Solich P (2006) T a lanta 68：908-918 ) ( [2] N guyen DTT， Guillarme D， Rudaz S， V euthey J-L (2006) Journal of Separation Science 29： 1 836-1848 ) ( [3] Carr PW， Wang X， Stoll D R (2009) Analytical Chemistry 81：5342-53 5 3 ) ( [4] Chen S， Kord A (2009) Journal of Chromatography A 1216： 62 0 4-6209 ) ( [ 5] G i lpin RK， Gilpin CS ( 2 007) A n alytical C h emistry 79 ： 42 7 5-4294 ) ( [6 ] Dunn W B ， Broadhurst D， B e gley P， Zelena E ， Francis-Mclntyre S ， Anderson N ， B rown M， Knowles JD， H a lsall A， H aselden JN， Nicholls AW， Wilson ID， Kell DB， 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