刺五加提取物中成分分析检测方案(液相色谱仪)

3 在线全二维液相色谱串联质谱分析刺五加提取物成分 张艳海 金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 提取物，刺五加，在线全二维，液质联用 引言 高效液相色谱技术已成为中药复杂体系研究的强有力的 分析技术支撑，在中药质量控制方面占据重要的地位。当前，随着新型色谱固定相和填料技术的不断发展，为中药各类成分的分析提供多种选择。然而很多中药复方中通常涵盖强极性、中等极性和弱极性等化学成分，这种性质决定了很难用单一的分离模式进行分离，复杂性超出了单一色谱分离系统的分离能力。在这种情况下，结合多种分离方式的多维色谱分离模式，可以增加色谱系统的分离能力，扩大分离空间，增加色谱峰容量， 减少色谱峰重叠。多维液相色谱分离技术已成为液相色谱发展的一个重要方向。 刺五加是五加科五加属的一种落叶灌木，主要的药用部分是它的根及根皮，药材名又称五加参，是中药五加皮的一种。我国民间很早就将其作为药材使用，以达到扶正固本，益智安神，补肾健脾的功效。其系统的化学研究已比较深入，主要含有甾体类、香豆素类、木质素类、酚类、糖类、三萜类及有机酸、微量元素等。本文拟采用全二维液相色谱分离技术结合质谱对刺五加水提取物 进行系统的物质基础分析。 测试条件 仪器： Ultimate DGP 3600 系统，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，三重四级杆串联质谱为 TSQ Quantum Vantage 一维分析柱： Hypersil GOLD PFP， 4.6×150mm×5pm 二维分析柱： Acclaim Polar Advantage lI C18 120A 4.6×50mm×3pm 柱温：40℃ 检测波长：254nm 进样量：5pL LOOP环体积：200ul -维色谱柱后分流比：1：4 流动相组成： 上样净化泵：A，甲醇；B，0.1%甲酸； 分析泵：A，乙腈；B，0.1%甲酸 一维和二维梯度分离程序见图1。 质谱检测条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描；喷雾电压3.5kV，毛细管温度350℃，雾化温度400℃；鞘气(Nz)流速是40L/min； 辅助气(N)流速是30L/min。 系统连接见图2。 图1.一维和二维梯度分离程序 图2.系统连接图 刺五加浸膏：取刺五加药材100g，粉碎成粗粉，加水煎煮2两次，每次3小时候，合并提取液，浓缩成浸膏即得。 取浸膏适量，加20%甲醇-水溶解，滤过进样。 对照品溶液制备：取紫丁香苷、绿原酸、异嗪皮啶、刺五加苷D和E适量，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液。 图3.刺五加药材中5种已知混合对照品3D谱图 (其中1为绿原酸，2和3为紫丁香苷，4为异嗪皮啶，5为刺五加苷E) 图4.刺五加提取物3D谱图 SMP2七xt 图5.刺五加提取物2D等高图 MS定性结果 本实验在确立了色谱条件后，在二维色谱柱后采用柱后 分离方式串联了 TSO， 对其中的主要成分进行结构确认工作，见表1、2。 表1.刺五加提取物中初步鉴别出的7个成分和分子量 序号 Compound Structure Molecular weight UV spectrum 1 L-sesmen (L-芝麻素) 354 60.07%50.0-37.5-25.0-12.5- 0.0- 210 250 300 350 390 2 chlorogenic acid绿原酸 OH OH9 HOOCOH 0H 354 60.01%50.0-37.5- 25.012.50.0 250 300 350 3 Syringin紫丁香苷 H3CO、OHYOH .CH2OH OH OCH3 OH 372 5025- -1 250 300 350 390 4 Isofraxidin-7-0-β- Dglucoside异嗪皮-7-0-葡萄 糖苷 H3CO、OH OH H H OH OCH3 OH H 384 % 100 250192.8 -29 250 300 350 390 5 Geniposide京尼平苷 0 HC 一·OH 0H OH OH 386 60.05225.2 300.140.020.0 -10P250 300 350 表2.其他未知化合物 Name RT (min) Ms spectrum 主要离子峰m/z UV spectrum Compound 8 16.91 13.41-14.20NL：5.72E5 269.05 2800730112 250268 90% 60260.44020 nm210 250 300 350390 Compound 9 19.06 24cEs 0.0001300.00019.02-1 7 SB： 24 17.20-17.33，17.60-17.78 NL： 2.26E5 370.06 250 300 二6450 369.06387.05 Compound 10 23.09 52020 NL：4.49E4 384.77 23.09 AV1F：-cESI 2486628305316.67 385.79 442.69 502.95 [150.DD0-1300.000]520.96530.2123123587.13 665.15 673.05NL： 1.04E5 00- 80- 60- cestaMs[150.000-1300.000]MS 40- 429.10 DD 430.1 515.19450 188325 68445 m/z Negative ESI：529.20384.77Positive ESI： 413.11 429.10 60.07%2599.0.07237.5.218.4 25.0 12.5. 0.0.m 210 250 300 350 390 Compound 11 23.21 FPESTCS9750.000-1300.0001 AV：1 NL：323E5 60-504040- 210.08 383.06 384.05 m/z Positive ESI：383.06 180T1% 10050261.1 nm 210 250 300 350 390*** Compound 12 29.35 NL：1.39E5 wRaTt：e2r9e x2t0ra cAtV#：412F21：[150.000-1300.000] 283.03 13241138307409.15455.27529.4456023580.18525.25684.84NL：9.73E4 393.03 same.Waterextract#4243RT：2935 AV：1F：·cESIQ1MS[150.000-1300.000] 60340-20 5.38610.09667.15600 650 Negative ESI：282.06 Positive ESI 不明显 无 UV 吸收 Name RT (min ) Ms spectrum 主要离子峰 m/z UV spectrum Compound 13 31.25 291 NL： 1.59E4 0.68-1310.302，311.436-S3B1.6984c31ESIQ1MS [150.000-1300.000] 4.78530.30 NL：3.92E4 389.12 SB30.90-31.11，31.48-31.96 F：+CESIQ1MS[150.0DD-1300.000] 36797 .18 09 500 Negative ESI： 529.19643.19384.78Positive ESI峰较乱 60.0 %299.840.0- 20.0 nml-10.0210 250 300 Compound 14 33.21 wract #4798-4806 RT： 33.19-33.24 AV： 4 SB： 64 30.68-31.02，31.46-31.98 NL： 9.30E4557.17 442.18 558.19 50 600.650miz Positive ESI：557.17442.18 350 90 270.1 5025- nm 191 250 300 350 390 Compound 15 33.26 50miz 529.20 NL： 6.15E4waterextract#4804-4813 RT：33.23-33.28AV：5F：-CESI Q1MS150.000-1300.000] 384.83520-20.9353024：160.69316.65 385.88 531.23 2.55 942.181081.42 1181.67223.06 NL：6.49E4 224.05 553.17 samoliwaterextract#4809 RT：33.26 AV：1F：+cESIQ1MS557.18 [150.000-1300.000]558.23 200 400 625.140325826.99927.03975.751127661225.96600 80D 1000 1200mlz Negative ESI：529.20384.83643.20(与化合物13 类似) 60.0T%299.540.0- 20.0-nm-10.0+ 210 250 300 350 390 Compound 15 33.35 #4821 RT：33.35 AV： 1 NL：7.46E5 365.05 6.05 381.03 D6.1325163 457.19 503.1553513100 350 400 450 500 550m/z Positive ESI：365.05 901% 261.4 50725 354.2nm 210 250 300 350 390 Compound 16 35.4 35.15，35.64-3 L： 1.19E5 266.10 397.07 267.12 4+++ Positive ESI：266.10207.04397.07 无紫外吸收 Compound 17 37.24 557.17 25.19 551 78.0988540194032-119196174928600 00900 1000 oo1200 1300 Positive ESI：557.17573.14 901% 270.25025 363.5 nm -102210 250 300 350 390 Compound 18 37.26 399-5408 RT： 37.34-37.40 AV： 5 SB：24 37.04-37.21，37.56-37.70 NL： 1.12E5397.08 7.16 398.04 420 480 520540560 Positive ESI：397.08497.16? 60.0 261.7 40.020.0 nm -10.0210 250 300 350 390 Name T(min) Ms spectrum 主要离子峰m/z UV spectrum Compound 19 43.37 IS[15500.0 1300.000223.01 F：+cES#6260-6274 RT：43.30-43.39 AV：7 NL： 3.59E5407.05224.03103 193.06 408.0 H4p 20D 1944m/z Positive ESI：407.05223.01 无明显紫外吸收 Compound 20 43.29 draci#6261 RT： 43.30 AV：1 SB： 31 43.08-43.21 539.12 224.03 200 43.3 1.93E5 539.12 540.11555.13 556.107005028383091011371474481238.16 Positive ESI：539.12555.13223.02 无明显紫外吸收 Compound 21 49.50 000-1300.0000 AV：1 NL：1.65E5 9083 C 20 54D.18 Positive ESI：539.16 60.0% 326.1 40.0- 20.0- -10.0nm210 250 300 350 390 2.在线全二维分离系统评价：与传统一维分离比较，在100min 内分离得到至少60个组分，结合MS 数据和已知文献对7个成分进行定性结构鉴别，另外化合物8~21在UV 或在 MS中响应较高，需进一步采用二级质谱进行结 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118 4006505118(支持手机用户) SCIENTIFIC AN_C_LC-   高效液相色谱技术已成为中药复杂体系研究的强有力的分析技术支撑，在中药质量控制方面占据重要的地位。当前，随着新型色谱固定相和填料技术的不断发展，为中药各类成分的分析提供多种选择。然而很多中药复方中通常涵盖强极性、中等极性和弱极性等化学成分，这种性质决定了很难用单一的分离模式进行分离，复杂性超出了单一色谱分离系统的分离能力。在这种情况下，结合多种分离方式的多维色谱分离模式，可以增加色谱系统的分离能力，扩大分离空间，增加色谱峰容量，减少色谱峰重叠。多维液相色谱分离技术已成为液相色谱发展的一个重要方向。  刺五加是五加科五加属的一种落叶灌木，主要的药用部分是它的根及根皮，药材名又称五加参， 是中药五加皮的一种。我国民间很早就将其作为药材使用，以达到扶正固本，益智安神，补肾健脾的功效。其系统的化学研究已比较深入，主要含有甾体类、香豆素类 、木质素类、酚类、糖类、三萜类及有机酸、微量元素等。本文拟采用全二维液相色谱分离技术结合质谱对刺五加水提取物进行系统的物质基础分析。