化学药中18种氨基酸衍生物检测方案

加压梯度毛细管电色谱分离18种氨基酸衍生物 茹琴华，罗国安，阎超等 摘要： 本实验为用加压梯度毛细管电色谱来分离18种氨基酸衍生物。用反相C18毛细管柱(粒径3um，130mm×75umI.D.)， 醋酸盐缓冲液 (50mmol/L NaAc， pH 6.4)，离子对试剂(1%N，N-二甲基甲酰胺)分离一标准溶液中的衍生化氨基酸(2ug/ml)， UV-Vis 检测器的波长为360nm， 毛细管柱的压力保持在大约70Pa，并在柱的出口端加 3kV 的正电压。研究电压对于氨基酸的洗脱次序和分离度的影响，发现当电压超过 3kV 时候 C18对氨基酸产生吸附作用。对盐浓度，进样量，和柱长度对于氨基酸分离的影响都进行了测定。氨基酸样品在 CEC 中分离，每个氨基酸迁移时间的 RSD 小于 2.5% 关键词：梯度洗脱、加压梯度电色谱，电色谱，氨基酸。 1、、介绍 毛细管电色谱(CEC)结合了两种著名的分析技术—―高效液相色谱(HPLC) 和毛细管电泳(CE)。它通过施加在毛细管柱(典型的是长25~50cm 和柱径50~150 m 的柱子)上的一个高电压来运作。此外它还结合了 HPLC 和 CE的原理，通过结合上述两种分离原理以及共同作用这项技术为分离科学带来了新的定量方法。CEC 具有高选择性(由于可选择多种的固定相和流动相)和能够轻易分离高极性和中性的化合物，拥有保持 HPLC 机械原理的好的特性。由于又增加了电渗流产生的柱塞状流型对比 HPLC 抛物线流型，使得该技术可以获得比同样用 HPLC高5~10倍的柱效。HPLC 和 CE 的结合使分析人员得到比单纯用任意一种技术所能提供的更大量的参数来调整已期获得最佳的分离离件。 到目前为止， CEC 实验已经在商业化的 CE 仪器和实验室制作的 CE 仪器上进行。这种方法的一个缺点就是如果缓冲液的浓度太高，在毛细管柱中很容易产生气泡，这将引起电流中断而破坏了分离。另外一个问题是尽管在商业化的 CEC 仪器上实现了分步梯度，但在这种仪器上不能够进行线性溶液梯度洗脱。我们研制了一种p-CEC 仪器包含两个泵，一个高电压模块和UV-Vis 检测器以及一个微流运行系统，该仪器能够在 CEC 的分离中实现线性梯度洗脱。 这一特性就是 EOF 结合了泵的压力，因此在机械分离的基础上包含电泳迁移和色谱分离。举例来说，分离一个中性和带电化合物的混合物可以通过简单地改变电压和泵压的比例而无须改变流动相的组份而实现分离。 CEC 分离中性物质的能力是众所周知的，但是很少有报道 CEC 在生化领域方面的应用。Huber 等人实现了在加压梯度 CEC 上分离12种氨基酸的衍生物。这里我们要用自制的 p-CEC仪进行18种L-氨基酸衍生物的分离。氨基酸能用许多方法来进行分离例如液质联用(LC-MS)，胶束电动色谱(MEKC)， 毛细管电泳(CE)，这些方法通常分离的时间从 30-50分钟不等。这儿，我们只用20分钟就实现了线性梯度洗脱pCEC 对 18种L-氨基酸的分离。结果证实 pCEC 仪器和这种分离方法是灵敏的、稳定的和精确的。 2、实验 2.1仪器 TriSep"2000GV CEC 系统(通微分析仪器公司)，两个泵(1u1/min-10ml/min 的流速，0-50MPa)， 个高电压模块(-3KV~+3kV)， -个UV-Vis 检测器(190-800nm波长)，个微流运行模块，，一个进样阀(20nl体积)，，一一个数据处理系统和一根电动填充柱。在泵混合同进样连接处有一个阀来保持柱压在大压 7MPa 左右。管路连接使用 PEEK 管。两个泵和一个毛细管柱就能进行微径 HPLC 的操作；一根毛细管柱和一个高电压模块就能进行 CE操作；两个泵，一根毛细管柱和一个高电压模块就能进行 p-CEC 操作。因此，一台仪器就能运行 micro-HPLC、CE 和 p-CEC 三种分离方式。 2.2柱和流动相 C18柱(3um粒径，130mm×75umI.D. 或者200mm×75umI.D.) 由通微技术公司(SanFrancisco， CA， USA) 提供。流动相A为50mmol/L醋酸钠(NaAc)和1%N，N-二甲基甲酰胺(pH6.4)，流动相B为50%的乙腈水溶液。 2.3 pCEC分离条件 在分离氨基酸时用线性梯度(在6分钟里A从60%到5%，然后保持5%)。分离时在毛细管柱上加 3kV 的正电压和大约 7MPa 的压力。流速50u1/min. UV-Vis 检测器的波长为 360nm。进样量20nl。在室温下进行实验。 2.4试剂和样品 Sigma 公司提供的18L-氨基酸标准品， Fisher Scientific 公司提供的乙腈。其他试剂由北京试剂公司提供。样品是由天津氨基酸公司提供。 2.518L-氨基酸衍生化 18种L-氨基酸标准品先溶解在25ml 容量瓶中，浓度为 1mg/ml。取 0.5ml 碳酸氢钠(NaHCO30.5mol/L)， 0.1ml 1%2，4-二硝基氟苯(乙腈溶液)和 0.5ml标准品溶液加入10ml容量瓶中混合充分。在60℃水浴中放置1小时。冷却后用磷酸盐缓冲液(PBS pH7.0)稀释定容。在进样前用 PBS 稀释到2ug/ml. 3、、结果和讨论 4、 3.1电压对pCEC 分离氨基酸的影响 图1显示不同电压下用 pCEC 分离18氨基酸的色谱图。随着电压的增大，灵敏度和分离度增加，能检测出的氨基酸峰增加。另外-个现象就是随着电压的增加，氨基酸的出峰次序也改变。当电压超过 3.5kV时，氨基酸峰都消失了。我们相信这是由于氨基酸被多孔的 C18柱吸附了。因此，分离使用 3kV正电压。 3.2梯度和盐浓度对pCEC 分离氨基酸的影 响用四种梯度洗脱程序来分离氨基酸标样。梯度1是70%A保持4分钟，在1分钟内从70%到30%，再在4分钟内从30%到25%，然后是在3分钟内从25%到5%，最后在1分钟 (图1) 内 从5%到2%；梯度2是在5分钟里A从70%到30%，再在5分钟里从30%到25%，然后在4分钟里从25%到5%，最后在1分钟里从5%到2%；梯度3是在6分钟里A从60%到35%，再在4分钟里从35%到20%，然后在2分钟里从20%到2%；梯度4是在6分钟里 A从60%到5%。发现分步梯度的分离时间要比线性梯度的分离时间长。另外，在分步梯度和线性梯度中分离度没有什么大的区别。而且，线性梯度的基线要比分步分度的平滑。因此，在 pCEC分离中选用线性梯度(梯度4)。 (图2) 表1显示了盐(NaAc)浓度与氨基酸迁移时间的影响；在线性梯度中用乙腈的百分比来计算迁移时间。随着盐浓度的增加，分离更快，分离度和柱效也提高了。为了避免在分离时产生气泡，我们使用50mMNaAco 研究进样量对灵敏度的影响。2 ug/ml 的标准品溶液分别进1秒(图2A)，3秒(图2B)和全量(20nl图2C)。很明显。随着进样量增加加高呈线性增加。在进样量20nl时甚至半胱氨酸和]组氨酸的峰也能被检测到，然而氨基酸的峰宽并没有增加。因此，使用20nl的进样量。 0 60 120 180 240 300 360 4220 Time ：) (图3) (图4) 3.4柱长度对pCEC 分离氨基酸的影响 图3显示了用130mm 长的毛细管柱在20分钟内就能完全分离氨基酸，用200mm长的柱需要40分钟。因为柱子变长也不能显著提高分离度，我们因此选用 130mm 长的柱子作为随后的实验用柱。 3.5鉴定用pCEC 分离的氨基酸 每一个单独氨基酸被分别衍生化，然后同18种氨基酸标准溶液按固定比例混合。混合体被pCEC 一个一个分离开来。根据峰高的增加，所有18个峰都被鉴别出来。酸性的谷氨酸：中性的丝氨酸和碱性的赖氨酸、精氨酸的鉴别都显示在图4. 3.6测定用pCEC 分离的氨基酸(见左图5)用 pCEC 分离氨基酸标准溶液5次，所有18种氨基酸迁移时间的相对标准偏差(RSDs)小于2.5%。每一个氨基酸都按照峰面积百分比计算，所有18种氨基酸含量的总和为100%。所 有峰面积百分比的 RSD 都小于2%。用 pCEC 分离氨基酸样品(图5)，15种氨基酸(除了半胱氨酸，精氨酸和赖氨酸)基本达到了定量控制的水平。 4、结论 加压梯度 CEC 的方法已经发展出来，用 pCEC仪分离18种氨基酸，并且结果证实了该仪器和它的方法是可靠的、灵敏的和精确的。pCEC 仪的特性就是能够分别或同时使用电压和泵压，使得它在分离混合物时电泳迁移和色谱分离都能够被利用起来。该仪器也能被用来做micro-HPLC 和 CE 分离模式。将来的提高着重在减少死体积，以及温度的控制和在生物化学研究领域更多的应用。