上海通微CEC分离农药及其代谢产物

农药及其代谢产 的毛细细管电色谱 离 我们在烷基苯和农药的毛细管电色谱分离中引入了表面键合甲硅烷基丙烷三烷基胺(简称 ODAS)的硅胶固定相。这种固定相同时具有产生正的电电流(EOF)的季胺功能团和产生反相色谱机制制溶质保留的十八烷基功能团。ODAS 固定相具有大范围的洗脱条件和烷基苯同系物的保留行为的特性，该固定相对农药的分离非常有效，并能进行在柱稀释的农药样品的富集，因此能使用UV检测器进行7×10M浓度的检测. 关键词：：毛细管电色谱、固定相、农药、样品富集 1. 介 绍 在毛细管电色谱(CEC)中，固定相有两个作用：1.保证色谱的选择择。2.提供不同迁移必须的EOF。因此，色谱介质的表面改性并不是我们所知的高效液相(HPLC)中产生固定相那样简单的转换。我们已经申请了专利，在 CEC 中使用特殊制作的固定相，包括部分改性的 ODS 固定相和十八烷基磺化硅胶固定相。这种ODAS的硅胶固定相含有一个十八烷基部分和一持久带正电的季胺基团。正电控制了驱动流动相通过柱子的 EOF 的大小和极性，，十八烷基决定了选择性，同传统的色谱中的反相膜相似。表面的改性同我们以前描述的熔融硅胶柱的蚀刻相似，也同在高效胶束液相色谱中硅胶颗粒的改性相似。然而，0DAS固定相同那些不同，因为它包含了短的季胺基团键合在硅胶表面，以确保一个高的正电流。另外，为了确保毛细管柱内的电荷的一致性，用于填充 CEC 柱的毛细管内壁也被改性，以携带正电荷。ODAS固定相对于一些物质(如烷基苯和农药)具有大范围的洗脱条件的特性。 设备： 该实验所用的设备为 HP毛细管电泳，并配备了一台UV二极管阵列检测器和由一台PC和ChemStation 软件组成的数字处理系统。毛细管柱用从Keystone科技公司购得的 Shandon 填料填充。 样品：本实验所用农药(除草剂)的结构如图1所示。 细管壁的涂布： _-长35cm的开管熔融硅胶毛细管首先用水漂洗，然后加满0.3MNaOH蚀刻毛细管内表面15分钟，接着用水和 0.3MHCL冲洗，以恢复毛细管内壁的中性，随后毛细管用干的 DMF冲洗，当加满TAC (溶于50%V/V甲醇)后，在120°C加热30分钟。该蚀刻过程应重复两次以上，以确保毛细 图1 固定相： 在这次研究 微型球状硅胶被5um ，平均孔隙硅胶首先同ODAC 瓶，再加入7.0g0DAC 图2 中，从杜邦公司采购的Zorbax PSM 150用于 CEC柱子充充。这种硅胶的直径为直径为150A，表面积为147m/g。这种进行反应，将2.0g硅胶颗粒放入圆底烧(溶于50%甲醇V/V)。悬浮液用桨式搅 拌器搅拌，反应在120°C下进行24小时。反应后硅胶通过离心收集，并用DMF漂洗，然后硅胶被放入一干净的圆底烧瓶中，同20ml的 DMF 混合，再同10g的 TAC (溶于50%甲醇V/V)反应，同预反应进程相同。在这之后，硅胶通过离心收集，用 DMF 和甲醇各洗两次。最后，收集的硅胶，用甲醇润湿，再在空气中干燥，图2b显示了硅胶表面的键合过程。因此获得的硅胶就是ODAS。 柱填充和成形： CEC柱按照前面描述的方法填充和处理。填充压力为3000psi，有时为4000psi 。柱子全部填充，无空白处。为了同 HPCE 系统相一致， CEC 柱总长度为32cm， 进口到检测窗口的长度为24cm。操作温度保持在20°C。 3. 结 果 和 讨论： 硅胶表面改性和 EOF 的大小及极性： 如图2b所示， ODAS固定相表面既有由季胺基团产生的并能产生 EOF的正电荷，又存在色谱保留机制的十八烷基功能团。在表面改性的过程中，要使用硅胶表面硅烷基三倍多的ODAC以产生0DAS固定相。尽管使用了大量的ODAC，但仍有一小部分硅烷基依然存在。为了使表面硅烷基尽可能地转变成季胺基团， ODAS固定相是无覆盖的，以便于第二步同过量含更短碳链的 TAC 反应。ODAS固定相既被填充于未蚀刻的毛细 管柱，也被填充于用 TAC 蚀刻过的毛细管柱。 水被注入柱塞内，以产生电渗流。在CE和 CEC 中观察到的水的空位峰被记录下来，并用于计算柱内的EOF 。使用由含水：乙腈为20：80(V/V)组成的电解液，其中含水相部分加入了5mM 的磷酸钠，PH为6.0等条件下，未蚀刻的开管柱中阴极电渗流测得为9×10m/sV。毛细管内壁用 TAC 蚀刻过后，开管柱中EOF 方向正好颠倒过来，从阴极向阳极移动，这时的值为 -5×10m/S*v 。从裸露的熔融硅胶柱到TAC 蚀刻的毛细管柱，电渗流的大小降 低了约44%，这是由于毛细管内表面的硅烷基未完全转化为 TAC 衍生物的缘故。 在未蚀刻或用 TAC 蚀刻过的熔融硅胶柱上被填充的0DAS固定相用于电渗流的研究以了解毛细管内壁对EOF 大小的影响，结果如图3所示。如同所预期的，在PH为3.0-8.0范围内，相同的条件下，蚀刻过的柱子比未蚀刻过的柱子具有更高的电渗流。在低PH时比高PH时，，EOF 大小的差距更大，如图3示。在PH为3.0时，蚀刻过的ODAS柱的 EOF 比未蚀刻的ODAS柱高40%，而在PH为8.0时，前者的EOF 仅比后者高14%。用 TAC 蚀刻过的ODAS柱的正电荷密度比未蚀刻的ODAS柱高，这是因为在后一艮柱子里，未蚀刻内壁的负电荷平衡了ODAS颗粒上的正电荷。当PH值增大时，这两种柱子的电渗流会下降，因为毛细管内壁和固定相表面的硅烷基完全电离。 固定相的色谱特性： 用六种烷基苯来研究ODAS固定相的色谱行为，并同先前我们制备的用作 CEC 固定相的部分被十八烷基覆盖的硅胶柱(ODS)所得的结果进行比较。与ODAS固定相表面内为一正的电荷相反，部分改性的 ODS为负电荷(被电离的残余硅烷基)而产生了 EOF，十八烷基提供了色谱的选择特性。这样制得的硅胶显示了强大的EOF， 同时也保留了反相色谱机制。 图4 图4a显示了ODAS柱在含水：.：有机流动相为20：80(V/V)条件下分离六种烷基苯的色谱图。在这个条件下前三种物质：苯、甲苯、丙苯并没有基线分离。平均柱效为53000理论塔板数/米。相当强的 EOF能使最后的物质在10分钟内洗脱出来。使用含水：有机流动相为50：50(V/V)，以上物质在30分钟内被分离出来，如图4b示。柱效为35000理论塔板数/米。图5a分别显示了各种百分比的有机改性剂条件 下的k'对数值和碳个数的图表。这些图表表明了ODAS固定相的反相机制。值得注意的是，由蚀刻柱和未蚀刻柱获得的k'值是相同的，表明了物质的分离主要是由固定相而不是毛细管壁控制的。 图5 图6 应用： 脲类除草剂的 CEC 分离： 通过用 CEC 分离九种脲类除草剂来研究ODAS固定相效率。分离在流动相为5mM磷酸盐 (PH为6.0)和乙腈为 50/50条件下进行，最后一个洗脱的峰(neburon )在15分钟内完成，如图6示。表2显示了ODAS柱获得的结果同前面我们用 CEC ODS 柱分离这些脲类除草剂的结果的比较，同表1的比较相似。ODAS固定相分离这些物质相比于部分改性的 ODS 具有更小保留，产生更 小的选择因子。ODAS的低柱效可能因为 EOF 的双极性。但在ODAS固定相上仍能获得这些物质的满意分离。 三嗪和其他除草剂的 CEC 分离： 我们也可以用 CEC 分离aldicarb、prometon、primetryne、propazine 和diazinon来研究ODAS固定相的应用(图7示)。prometon、primetryne、propazin的结构非常相似，而 pK。 值不同，各为4.20、1.85和4.05。在图7的条件下，， triazines 除草剂是中性的。这些物质根据他们疏水特性不同而洗脱，换句话说， prometon在 propazine 后洗脱出来，紧接着是primetryne。当PH为3.0时洗脱次序会发生改变，这时 triazines、 prometon 图7 和 propazine 带正电荷。 在柱富集： 我们选择了具有代表性的aldicarb、propazine、diazinon和 dineburon 混合样品来进行研究。我们发现由2mM磷酸盐(PH 6.0)和乙腈(20/80V/V)组 成的流动相可以得到快速无塞形水流时的检测限为同的操作条件下，通过在改变水流的长度，获得了犁形水流在-1KV注入，时水流长度分别为1.9mm、示了diazinon的信号灵敏度增至最大值，然后下流比未注入时的灵敏度大同。随着在-1KV电压下注 图8 的基线分离。对于ODAS固定相，10M，如图8a示。那么，在相进样之前变化注入水流的时间来信号灵敏度同水流长度的关系。间分别为30、60、90和120s时，3.8m、5.6mm 和7.5mm。图9显度，随着塞形水流的注入，灵敏降。对于diazinon， 注入犁形水将近四倍，图8b显示了这些不入水流90s)S(相一致的水流长度 约为5mm)，这种流动相条件下(磷酸盐/乙腈=20/80V/V)的检测限为3×10M。 塞形水流能增加样品的富集是因为增加了样品对固定相的吸附。在注入水和样品之前，固定相的表面先用含有高浓度的乙腈(80%V/V)平衡。注入的水流稀释了柱子进口端的乙腈浓度，在注入样品之前形成了一个固定相表面保留增加的区域，在这个区域，当进样后会便于样品的富集，延长注入水流时间会达到一个样品数量开始下降的临界点，这是因为 EOF 的下降并最大限度地产生气泡(图9示)。总的来说，固定相的保留在在柱富集中起到了一个重要的作用。增加保留的溶剂也会有助于样品富集，从而允许稀释样品的检测。 图9 鉴于这些理论基础，我们也研究了流动相为30%和40%的5mM磷酸盐，PH为6.0时的样品富集，结果示于图10中。作为比较，流动相中含水为20%、30%和40%时，检测限分别为3×10M、、1×10M和7×10M。在这些实验中，高的含水浓度增加了固定相的保留。正如所预期的，通过预先注入增加保留特性的溶剂和使用含高浓度增加保留的溶剂的流动相都有利于样品富集。 4. 结 论 新的ODAS固定相有利 于中性的农药的存在一个阳性的关。当与存在负电EOF 的 ODS 固定相溶质(如烷基苯和的保留，并降低了而， ODAS柱存在一这通过疏水性溶质机改性剂浓度的依 ODAS固定相可以进 图10 CEC分离， ODAS 中EOF，大小与PH值有荷，能产生阴性的相比，ODAS对疏水性除草剂)会产生更小他们的选择因子。然个标准的反相机理，的保留对流动相中有赖可以说明。另外，行在柱稀释样品的富 集。根据以上的特点， ODAS在 CEC 分离中的应用非常广泛。进一步的研究将集中在 ODAS固定相的色谱行为。