奶制品中乳铁蛋白检测方案

应用分享：奶制品中乳铁蛋白的测定(团体标准 TTDSTIA 006-2019) 背景 近日，天津市奶业科技创新协会发布了《团体标准 T/TDSTIA 006-2019奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法》，我们根据标准要求的前处理方法进行了奶制品中乳铁蛋白的测定验证，纳谱分析提供的SelectCore Heparin 肝素亲和 SPE 柱和 ChromCore 300 C4-T分析柱，不仅能满足此标准的检测要求，相比标准所列的 GE HiTrap Heparin 前处理柱和 Waters 的 Xbridge Protein BEH C4分析柱，前处理更加方便快捷，色谱分析时间更快更准确，可以更加快速高效的检测乳铁蛋白的含量。 TNB 团 体 标 准 T/TDSTIA 006—2019 2019-11-26发布 2019-12-01实施 天津市奶业科技创新协会 发布 适用范围 该方法参考团体标准奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法(T/TDSTIA 006-2019)，用于测定生乳、液态奶和乳粉中乳铁蛋白的含量。 实验步骤 1、试剂准备 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取4.0g氢氧化钠，加水溶解，定容至100mL. 磷酸缓冲盐溶液1：称取磷酸氢二钠 23.85 g， 磷酸二氢钠 4.99 g，加水溶解，用氢氧化钠溶液调节 pH至7.50，定容至1L，混匀备用。 磷酸缓冲盐溶液2：称取磷酸氢二钠5.96g， 磷酸二氢钠0.96 g， 氯化钠 5.84g，加水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH至7.50，定容至1L，混匀备用。 磷酸缓冲盐溶液3：称取磷酸氢二钠5.96 g， 磷酸二氢钠2.50 g，氯化钠119.30g，加水溶解，用氢氧化钠溶液调节 pH至7.50，定容至1L，混匀备用。 乳铁蛋白标准品：：乳铁蛋白母液，浓度10mg/mL， 称取1.0 g乳铁蛋白加水溶解，定容至100mL。 2、样品制备 生乳、液态奶：称取10.0g试样于 50 mL离心管中，加入磷酸缓冲盐溶液1定容至50mL， 混匀，离心 15 min， 吸取 25 mL 中间层试液于另一50 mL离心管中，离心15 min。吸取上清液，待净化。 乳粉：称取5.0g试样于50 mL离心管中，加入磷酸缓冲盐溶液1定容至50mL， 混匀，离心15 min，吸取 25 mL 中间层试液于另一50 mL离心管中，离心15 min。吸取上清液，待净化。 3、净化 SPE 柱活化： SelectCore Heparin 肝素亲和柱1mL， 加入 10 mL磷酸缓冲盐溶液2进行活化； 上样：准确移取10 mL步骤2中制备好的上清液； 淋洗：待上清液完全流出后，再用10 mL磷酸缓冲盐溶液2淋洗，弃去全部淋洗液； 洗脱：用4.5mL磷酸缓冲盐溶液3洗脱，收集全部洗脱液，用磷酸缓冲盐溶液3定容至5.0mL。将收集溶液涡旋混匀，过滤膜后供液相色谱分析。 4、液相色谱仪器条件 色谱柱： ChromCore 300 C4-T5um， 4.6x250mm 检测波长：280nm 柱温：30°℃ 进样体积：20pL 流速：1.0 mL/min 流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液；B相：乙腈 洗脱梯度： 时间 (min) 济速(mL/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 1.000 70 30 15 1.000 40 60 16 1.000 70 30 26 1.000 70 30 实验谱图及加标回收率数据实验谱图 图1 乳铁蛋白标准品色谱图 图2 奶粉基质色谱图 图3 奶粉基质加标色谱图 加标回收率数据 加标量 100 mg/Kg 107.97% 由图3可知，经过 SelectCore Heparin 固相萃取柱净化的奶粉样品，，目标物峰型优良，无杂质干扰，并且加标回收率符合检测要求。 Tips 1： 在配制磷酸盐缓冲溶液的时候，标准要求用 10 mol/L 来进行调节 pH， 但是我们在做的时候，发觉氢氧化钠溶液浓度较高时，调节磷酸盐缓冲溶液 pH较为困难并且会影响其他蛋白的共洗脱，因此我们建议氢氧化钠溶液浓度为1 mol/L 最佳； Tips 2：标准要求的分析柱规格是 Xbridge Protein BEH C4 3.5um，4.6×250mm， 流速1.5ml/min， 柱温60℃，试验证明，这个流速柱压压力较高，并且长期在这么高的柱温下对色谱柱寿命不太好，我们选择纳谱分析的 ChromCore 300 C4-T 5pm， 4.6x250mm， 经过验证后的流动相梯度程序，流速是 1.0ml/min， 柱温是30℃，这个方法相比标准方法来说，系统压力较小、分析柱寿命提高、分离度满足要求，更重要的是，出峰速度比标准图谱也快了3分钟，可以加快样品分析时间。 纳谱分析NanoChrom纳谱分析技术(苏州)有限公司Phone： E-mail： customerservice@nanochrom.com Web： www.nanochrom.com 加标量加标回收率100 mg/Kg107.97%