脱脂奶中蛋白质检测方案(定氮仪)

应用文章 2008 消解仪K-435，自动蒸馏仪 K-370 用双氧水和硫酸消解测定脱脂奶中的蛋白质 1前言 两种消解方法的比较研究(用硫酸+双氧水和于2004年 A.M.Rossi et al 出版的的传统的凯氏消解方法)说明这两种方法对于众多食品材料来说都可以得到理想的结果。作为催化剂使用的双氧水或过硫酸在氧化降解中的作用很久之前就已经了解了，该应用文章的旨在说明双氧水在消化过程的优势。 使用双氧水的好理由： -本质上缩短了消解时间，如牛奶消化的30min 替代了90min -消化牛奶样品的时候不起泡沫 -消化样品不会被盐或金属催化剂污染，并且可以进一步的分析除氮以外的元素 -由于不使用金属盐，对环境有更小的污染 -用69%的硫酸替代98%的硫酸，从而减少化学试剂的污染 2原理 凯氏方法是官方 (AOAC 928.08， LFGB S64 L06.00-7， SLMB 314.1)测定食品和饲料中氮和蛋白质含量的方法。过程可总结为下面的步骤： -样品制备 -添加双氧水于硫酸中消解样品，将蛋白质中的氮转化为硫酸铵 -将硫酸铵转化为氨气 -氨气蒸馏至硼酸溶液中 -用硫酸标准溶液直接滴定硼酸铵盐 3仪器 -消解仪K-435 -H202玻璃件 Buchi(037399) -尾气吸收仪B-414 -自动凯氏定氮仪K-370 -凯氏进样器K-371 4 化学试剂 -凯氏催化剂，无汞和硒， Buchi (028765) -98%的硫酸，如Fluka (84727) -30%的双氧水 -69%的硫酸， Fluka (84723) -玻璃棉，如Fluka (20411) -40-150目的沙子，如Fluka (84878) -32%的氢氧化钠溶液，如Riedel-dehaen (30531) -4%的硼酸溶液，如 Fluka (15660)， 200g的硼酸溶于5L 蒸馏水中，调节pH至4.65-0.25mol/L的硫酸标准溶液，如Riedel-dehaen (35355) 5样品 本地超市中购买的脱脂奶“奶1”奶“奶2”。容器上标示的蛋白质含量为3.2[gP/100mL]。 6过程 6.1.1漏斗制备 可选的抽吸管可以通过玻璃漏斗添加本次实验所用的双氧水。漏斗预先用玻璃棉塞住流出口处，用约10g 的推荐的沙子填漏漏斗的狭窄部分。顶部的沙子用一层玻璃棉盖住以保证沙子在玻璃里。 6.1.2样品制备 在每个玻璃管中加入30mL69%的硫酸和 10mL30%的双氧水。三个玻璃管做空白其它六个样品管中加入5g的牛奶。 6.2消化 用一个耐酸橡胶真空管连接消解仪K-435 和尾气吸收仪 B-414。K-435在10档处预热，同时在10档处工作 15min。预热后，将两排样品架装入消化炉中。10分钟后，通过装在抽吸玻璃管顶部的漏斗加入20ml 的双氧水。双氧水需要 10-15min 滴落到反应管中。30min 总反应时间后，关闭K-435，提升样品管并冷凝至室温。 表1双氧水消化的非参数 步骤 加热位置 时间[min] 预热 10 15 10mL 双氧水的初反应 10 15 20mL 双氧水的第二步骤 10 15 总消化时间 10 30 6.3蒸馏和滴定 冷却后的样品转移到K-371上的样品架中。蒸馏之前，需要对仪器进行试运行程序以此来调节蒸馏仪。蒸馏和滴定参数如下所示： ( 1 Buchi 现提供了新型的漏斗用于添加H202 而无需用沙子准备。请参见 W www. buch i. com . ) 表2在自动蒸馏仪 K-370上应用的蒸馏和滴定参数 蒸馏 滴定 水 50mL 类型 硼酸 NaOH(32%) 90mL 滴定溶液 H2S04 0.24M 反应时间 5s 吸收液体积 60mL 蒸馏时间 240s 最小滴定时间 5s 蒸汽力度 100% 最大滴定时间 40mL 滴定类型 标准 排空样品 是 滴定终点类型 终点 排空回收液 是 终点pH值 4.65 搅拌速度 5 运算 1 搅拌速度 7 7计算 结果表示为氮的百分比。为了及苏三样品的蛋白质含量，氮含量需要乘上样品的蛋白系数(牛奶的蛋白系数为6.38)。 使用下面的公式(1)，(2)和(3)计算结果 W(N) ：氮的质量分数 Vsample ：样品消耗的滴定酸体积[mL] Vblank ：空白消耗的滴定酸体积[mL] Z ：摩尔系数(硫酸是2) ：滴定酸浓度[mol/L] ：滴定系数(商业溶液一般为1.0) M (N) ：氮的某而重量(14.0067g/mol) msample ：样品质量 PF ：样品的蛋白系数(牛奶为6.38) ： N的百分质量 ：蛋白质的百分质量 8结果 用双氧水消化两个系列的脱脂奶样品和空白。表3给出的第一个系列的结果，表4给处的是第二个系列的结果。 为了判断反应的完全性，测定的蛋白质含量与标签中标示的来做比较。表3和表4中消 化30min后得出的结果与预期的蛋白质含量[3.2gP/100mL]吻合度很好。 “奶1”和“奶2”中用传统的凯氏测定方法得出的蛋白质含量为3.4和3.3%， 其RSD分别为0.78，0.53%。 表3测定“奶1”中的氮和蛋白质 空白 滴定酸[mL] 1-3 0.142 样品 质量 滴定酸[mL] N% 蛋白质[%] 1 5.0737 3.984 0.530 3.4 2 4.9866 3.822 0.517 3.3 3 5.1019 3.884 0.514 3.3 4 5.0688 4.009 0.534 3.4 5 5.2453 4.129 0.532 3.4 6 4.8445 2.761 0.523 3.3 平均值 0.525 3.4 S 0.009 rsd 1.6% 空白 滴定酸[mL] 1-3 0.229 样品 质量 滴定酸[mL] N% 蛋白质[%] 1 5.1307 3.986 0.513 3.3 2 5.1855 4.014 0.511 3.3 3 5.0677 3.956 0.515 3.3 4 5.0826 4.011 0.521 3.3 5 5.0277 3.963 0.520 3.3 6 5.0097 3.965 0.522 3.3 平均值 0.51 3.3 S 0.00 rsd 0.50% 9与标准方法比较 为了验证结果(参见p.4的8个结果)，用双氧水消化的两种样品也用 ISO 8968标准方法来消解。用双氧水消化得到的结果与使用凯氏消化片的标准方法得到的结果是一样的。用双氧水的方法和用凯氏催化剂片的标准方法之间最组要的区别如表5所示： 表5：与标准方法的比较 该应用文章 标准方法 偏差原因 消化时间 25-30min 90min H202较快 硫酸 69% 98% H202在98%的硫酸中分解 ( [1] A.M. Rossi， M. Villarreal ， M.D. Juárez， N.C. Samman， J. Argent. Chem. Soc. 2004， 92， 4-6 ) ( [2] Buchi Application No. 3XX079EN， Version B， Application No. 3xx001en， Version D (2002) ) ( [3] C.C. Hach， S.V. Brayton， A.B. Kopelove ， J . Agric. Fo o d Chem. 1985， 33 ， 1117-1123 ) ( [4] Milk - Determination o f nitrogen c o ntent - P a rt 1 ： Kjeldahl method (ISO 8968-1：2001) ) ( [5] Meyers Lexikon online： http：//lexikon.meyers.de， Bibliographisches Institut &F.A.Brockhaus AG，27. Februar 2007 ) ( [6] 'Die Stickstoffbestimmung nach Kjeldahl， Die Umrechnung v o n Stickstoff zu P rotein，Literaturstudie und Erfahrungsbericht， M. Ugrinovits， Wander AG， 3176 Neuenegg， VerlagBuchi Laboratoriumstechnik GmbH， Goppingen ) 用号： K-.. copyright @Buchi Labortechnik AG 两种消解方法的比较研究（用硫酸+双氧水和于2004年A.M.Rossi et al出版的的传统的凯氏消解方法）说明这两种方法对于众多食品材料来说都可以得到理想的结果。作为催化剂使用的双氧水或过硫酸在氧化降解中的作用很久之前就已经了解了，该应用文章的旨在说明双氧水在消化过程的优势。使用双氧水的好理由： -本质上缩短了消解时间，如牛奶消化的30min替代了90min -消化牛奶样品的时候不起泡沫 -消化样品不会被盐或金属催化剂污染，并且可以进一步的分析除氮以外的元素 -由于不使用金属盐，对环境有更小的污染 -用69%的硫酸替代98%的硫酸，从而减少化学试剂的污染