酱油中防腐剂检测方案(饮用酒检测仪)

高效液相法检测复杂基质样品中的防腐剂 李雪芳，戴绚丽 杭州娃哈哈集团有限公司质量监控部，杭州310018 摘要：复杂基质样品中由于干扰因素多，且干扰物质难于去除，因此很难准确测定其中防腐剂的含量。本研究采用蒸馏法，用 BUCHI自动蒸馏仪在酸性条件下将防腐剂苯甲酸、山梨酸能同水蒸气一起蒸馏出来。利用高效液相色谱对收集所得蒸馏液进行测定。研究结果表明用该方法处理的食品样品净化完全，无干扰。测定结果具有良好的准确度和重现性，非常适合酱油、酱包、乳酸链球菌素等复杂基质样品中防腐剂的测定。 关键词：蒸馏法； BUCHI自动蒸馏仪；防腐剂；复杂基质样品；高效液相色谱 Determination of Preservatives in Complex Matrix Samples by HighPerformance Liquid Chromatography Abstract： Determination of preservatives was often very difficult in complex matrix samples， forthe presences of various interferents. In this study， a distilling method was proposed to co-distillbenzoic acid and sorbic acid with water from complex matrix samples in acidic condition byBUCHI distillation unit.. Then the distilled liquid was determined by high performance liquidchromatograph. The results showed that the samples could be purified entirely and there were nointerference in the distilled liquid. The proposed method is rapid， accurate and suitable fordetermined preservatives in complex matrix samples， such as soy sauce， seasoning bags， nisin andSO on. Key words： distilling； BUCHI distillation unit； preservatives； complex matrix samples； highperformance liquid chromatography 高效液相色谱法作为食品中防腐剂检测的标准方法，广泛地用于各种饮料，食品以及各种原辅料的质量控制中[1，2，3]。但是对于基质较为复杂的样品，如酱油、酱包、桂圆肉、乳酸链球菌素等，我们以往的预处理方法是：对于酱包/浓缩汁，用水稀释后，加热超声萃取，离心去除油层后上过滤，再进样分析。对于酱油样品，稀释过滤后直接进样分析。对于乳酸链球菌素，用水稀释，超声，离心过滤后进样分析。该预处理方法简单，但是由于样品中存在色素，蛋白质，脂肪等多种干扰物质，上述预处理方法无法将干扰物质去除干净，使得苯甲酸和山梨酸与存在的多种干扰物质在色谱柱很难分离，因此很难获得满意的检测结果。同 时，大量的杂质对色谱柱会造成污染，严重影响色谱柱的性能[4.5]。为此我们根据苯甲酸和山梨酸在酸性条件下能同水蒸气一起蒸馏出来的特点的6]，采用水蒸气蒸馏法，用 BUCHI自动定氮仪对样品进行预处理，探讨了不同蒸馏条件下对检测结果的影响，建立了一种对复杂基质食品中防腐剂适用的简单、快捷的前处理方法。 1实验部分 1.1试剂与仪器 1.1.1主要试剂 甲醇，乙腈为色谱纯 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取 1.54g乙酸铵(优级纯)，加水至1000ml，溶解，经滤膜(0.45um)过滤。 苯甲酸标准工作液：将1mg/ml 苯甲酸储备液稀释1000倍作为工作液。 山梨酸标准工作液：将 1mg/ml 山梨酸储备液稀释1000倍作为工作液。 1.1.2主要仪器 Waters 高效液相色谱仪 BUCHI 自动蒸馏仪 1.2色谱条件 色谱柱： Aglient Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6x150mm； 流动相：乙酸铵溶液：甲醇=90：10流速：1.0ml/min检测器：二极管阵列检测器进样量：20pL 检测波长： 苯甲酸 230nm 山梨酸254nm 1.3色谱条件 准确称取 10.00g 均匀样品，置于蒸馏管内，加磷酸 1ml，无水硫酸钠 20g， 水15ml，在接受瓶中加入 320pL1mol/L 氢氧化钠，加入少量蒸馏水。BUCHI 自动蒸馏仪蒸馏强度100%蒸馏 5min， 收集馏出液，用水定容到200ml， 馏份份0.45um 滤膜过滤后进样。 1.4定量方法 根据保留时间定性，外标峰面积法定量。 2结果与分析 2.1不同前处理方法检测结果的比较 图1(a)和1(b)为不同前处理方法对酱包样品处理后所得的色谱图。图2(a)和1(b)为不同前处理方法对乳酸链球菌素样品处理后所得的色谱图。图1(a)和图2(a)的预处理方法为我们以往使用的预处理方法。图1(b)和图2(b)的预处理方法为本文提出的水蒸气蒸馏法。从图中可以看出，用以前的超声萃取方法检测酱包中的苯甲酸时，由于其基质复杂，干扰成分较多、黏度较高，造成了进样后杂质峰过多，色谱峰分离度无法满足要求，即使用200mm色谱柱，用梯度洗脱，也无法将防腐剂与污染物质完全分离。而采用水蒸气蒸馏处理后，样品能完全被净化，基本无基质干扰，因此用150mm色谱柱， 5min 内就可将苯甲酸和山梨酸完全分离，因此可以满足大批量样品的快速测定。另一方面，由于蒸馏后上机测试的样品较干净，因此在实际的分析测试中，可以加大进样量，进--步降低方法的检测限。 图1(a) 酱包超声萃取处理后样品的色谱图 图1(b)酱包水蒸气蒸馏处理后样品的色谱图 图2(a) 乳酸链球菌超声萃取处理后样品的色谱图 图2(b)乳酸链球菌水蒸气蒸馏处理后样品的色谱图 2.2前处理条件的优化 2.2.1蒸馏强度的选择 蒸馏强度对苯甲酸和山梨酸的蒸发程度存在一定影响，本实验考察了不同蒸馏强度对苯甲酸和山梨酸回收率的影响，结果如表1. 表1.蒸馏强度对回收率的影响 蒸馏强度(%) 80 95 100 苯甲酸回收率(%) 63 72 85 山梨酸回收率(%) 77 87 89 随着蒸馏强度的增大，苯甲酸和山梨酸的蒸出率不断增大。因此，选择选择蒸馏强度100%。 2.2.2无水硫酸钠加入量的影响 加入无水硫酸钠的目的是使样品溶液的沸点升高，从而使苯甲酸和山梨酸尽可能蒸馏出米。加入不同量的无水硫酸钠做加标回收试验，结果见表2. 表2.无水硫酸钠加入量对回收率的影响 无水硫酸钠加入量(g) 1 5 10 20 25 苯甲酸回收率(%) 43 65 76 80 80 山梨酸回收率(%) 66 86 86 88 89 从上表可以看出，无水硫酸钠的加入量对回收率有较大的影响，但当无水硫酸钠的加入量达到20g后，苯甲酸和山梨酸的回收率增加不明显。因此选择无水硫酸钠的加入量为20g。 2.2.3 磷酸加入量对回收率的影响 山梨酸和苯甲酸可能以山梨酸盐和苯甲酸盐的形式存在于样品中，加入磷酸的目的是使样品酸化，使防腐剂从盐的形式完全转化为酸的形式从而能随水蒸气蒸馏出来。考察了不同体积的磷酸加入量对结果的影响，结果见表3。 表3.加入不同体积磷酸对回收率的影响 磷酸加入量(ml) 0.2 0.5 0.8 1.0 1.5 苯甲酸回收率(%) 75 77 77 82 82 山梨酸回收率(%) 83 84 86 87 87 在实验中发现，加入磷酸的量增加，山梨酸和苯甲酸的回收率增加，当加入磷酸量增加到 1ml 后，进一步增加酸度山梨酸和苯甲酸的回收率增加不明显。 2.2.4 氢氧化钠吸收液加入量的选择 调节接受液的 pH 值会影响苯甲酸和山梨酸的在水中的吸收效率。实验考察了接受瓶中加入不同量 1mol/L 氢氧化钠溶液对苯甲酸和山梨酸回收率的影响，结果见表4。 表4.氢氧化钠吸收液加入量对回收率的影响 氢氧化钠溶液加入量 0 20 100 160 320 340 (ul) 苯甲酸回收率(%) 70 75 77 79 87 84 山梨酸回收率(%) 81 89 94 95 95 93 随着氢氧化钠加入量的增加，吸收液的PH升高，苯甲酸和山梨酸的吸收效率增加，当氢氧化钠加入量到320ul时，回收率可达到要求，因此选择加入 1mol/L 氢氧化钠 320 ul. 2.3方法的定量限，重现性及回收率考察 取样品按本方法进行预处理后测定，以信躁比10，确定了该方法的定量限分别为苯甲酸 0.035mg/L；山梨酸0.01mg/L。 对同一样品按本方法平行测定6次，测定结果如表5所示。从表中结果可以看出，采用该方法，苯甲酸和山梨酸测定的相对标准偏差均小于10%，这一结果说明了本方法具有很好的重现性，测定结果可靠。 表5方法重现性测定实验结果 平行测定样品 平均值 相对标 1 2 3 4 5 6 准偏差 苯甲酸 0.052 0.057 0.053 0.054 0.060 0.051 0.0545 6.2% (mg/L) 山梨酸 0.053 0.051 0.049 0.050 0.050 0.053 0.051 3.3% (mg/L) 用水蒸气蒸馏法处理乳酸链球菌素，计算回收率，测定结果如表6所示。 表6乳酸链球菌素中苯甲酸，山梨酸加标回收率 样品号 样品中含量 添加标准品含量 实测加入标准品含量 回收率 (mg/L) (mg/L) (mg/L) (%) 苯甲酸 1 0 0.05 0.045 90.0 2 0 0.10 0.092 92.0 3 0 0.20 0.182 91.0 山梨酸 1 0 0.05 0.047 94.0 2 0 0.10 0.095 95.0 3 0 0.20 0.188 94.0 3结论 本研究针对复杂样品中防腐剂测定过程中存在的基质严重干扰的问题，采用在酸性条件下水蒸气蒸馏法进行前处理，对样品进行净化，建立了高效液相色谱测定复杂基质样品中防腐剂的方法。通过实验确立了最佳的前处理条件以及色谱条件。该方法简便、快速，且重现性好，回收率可达到80%以上，能够用于日常分析检测。 ( 参考文献： ) ( [1] GB/T5009.29-2003.食品中山梨酸、苯 甲 酸的测定[S]. ) ( [2]黄百芬，张文娟，沈向红.高效液相色谱同时测定酱油或饮料中的8种防腐剂[J].中国 卫生检验杂志，2005，15( 1 0)：12 0 8—12 1 1. ) ( [3]陈海燕，崔永立.高效液相色谱法测定熟肉制品中的苯甲酸、山梨酸[J].中国卫生检验 杂志，2 0 07，17(3)：545—546. ) ( [4]彭曙光.高效液相色谱法测定蚝水中山梨酸和苯甲酸的含量[J].现代科学仪器，2001，1： 58—59. ) ( [5]刘渭萍 ， 李明，孙蕊.高效液相色谱法快速测定酱油、醋中的苯甲酸和山梨酸[J].辽宁 化工，2004，3 3 (7)： 4 21—423. ) ( [6]义志忠，彭寨玉.高效液相色谱法测定月饼中山梨酸[J].中国卫生检验杂志，2004，14(2)： 214—214. )