大麻中赭曲霉素A检测方案(液相色谱仪)

Application No.SSI-HPLC-019News http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2019年4月400-650-0439 引言 黄曲霉毒素和赭曲霉毒素均属于真菌毒素，是曲霉属霉菌物种产生的次生代谢产物。研究发现，包括黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2和赭曲霉毒素A在内的众多真菌毒素均具有免疫抑制性、致癌性、神经毒性和肝毒性1.3。霉菌本身也会引起肺部感染和曲霉病等疾病11.3。考虑到大麻中存在的真菌毒素以及可能的霉菌生长会对消费者健康构成巨大的风险1，2]，所以开发准确检测大麻中真菌毒素的方法至关重要。 随着各大州相继出台允许药用或娱乐用大麻使用的政策，也出现了更多关于大麻产品检测的法规。现有的大麻检测方法包括 ELISA、 qPCR 和MALDI-ToF-MS；它们在成本、范围、制备时间和质量精度方面各有利弊。例如， ELISA 并不十分精确，还会经常给出假阳性或阴性结果，并且需要进行昂贵的额外仪器检测才能确认 ELISA 的结果。此外，由于大麻产品的基质极其复杂，因此检测大麻中的真菌毒素极富挑战性。本研究旨在开发一种强大的检测方法，以供大麻检测实验室有效获得低于法规限值的浓度-黄曲霉毒素B1、B2、G1和 G2 合并为 20ppb，赭曲霉毒素 A 单独为20 ppb。 ■ 实验 样品制备 在 50ml 离心管中称出1克样品，并使用 SPEX 研磨仪均匀研磨。然后将10mL甲醇和水(80：20) 的混合液加入管中。 标准品和校准 使用 SPEX Geno Grinder高通量组织研磨仪，将混合物剧烈振荡10分钟，然后以 3600rpm 的转速离心3分钟。将 2.0mL上清液转移到含有 8.0mL 含2%吐温的PBS洗涤缓冲液的新管中并充分混合。将 10ml稀释的提取物以每秒1-2滴的速率通过 AflaOchra固相萃取柱(参见图1)，直到空气通过色谱柱。注意，在使用这些色谱柱时，流速请勿超过每秒1-2滴，否则会降低回收率。同样地，用 10mL 含2%吐温的PBS缓冲液洗涤色谱柱，然后用10mL HPLC 级水洗涤。最后，用 2mL 甲醇洗涤色谱柱，每次使用1mL，并在同一管中合并。 使用高灵敏度模式来构建标准曲线，2、5、10、14、20和50ppb 用于黄曲霉毒素检测，10、14、20和50ppb 用于赭曲霉毒素A， 每个浓度点平行进三份。所有标准品均加入基质中并进行提取，因此用于黄曲霉毒素的进样的实际浓度为0.2、0.5、1.0、1.4、2和5 ppb。赭曲霉毒素A不需要较低的检出限，因为其本身的检出限为20 ppb；四种黄曲霉毒素总和为20ppb. 分析条件 色谱柱 NexLeaf CBX for Potency 2.7 umx150mm x 4.6 mm 流动相 A：含有0.1%甲酸的水，B：含有 0.1%甲酸的甲醇，C：含有0.1%甲酸的乙腈 时间程序 浓度A/浓度B/浓度 C=65/30/5(0.00-2.00)→升至23/40/37 (2.00-10.00)→23/40/37(10.00-12.00)→65/30/5(12.01-14.00) 流速 1.3 mL/min 色谱柱温度 50 °C 进样量 10 uL 检测 RF-20AXS，通道1：Ex=365nm Em=450nm， 通道2： Ex=336，Em=464，通道3： Ex=330Em=460， 通道4：Ex=350Em=450，高灵敏度模式 池温度 30°C 此处使用的色谱柱和液相色谱系统(i-SeriesLC-2030) 也适用于大麻效力分析，因此大麻实验室可以在当前装置中添加RF-20AXS 来扩展其分析能力。 ■ 结果和讨论 通道1，365 nm激发和450nm发射，为所有黄曲霉毒素提供了最佳响应；赭曲霉毒素A 选择通道3，330nm激发和460nm的发射，不过通道2也很合适(参见图2)。黄曲霉毒素G1 在所有黄曲霉毒素中响应最低，但即使在最低浓度 2 ppb 条件下，通道1仍然为分析提供了高质量的数据。每种化合物的标准曲线R^2值为0.998或更大，表明线性良好。 图2：黄曲霉毒素 G1 2 ppb (左)和赭曲霉毒素 A 10 ppb(右)的色谱 图3：黄曲霉毒素 G1(上图)和赭曲霉毒素A(下图)的标准曲线 样品加标10 ppb真菌毒素，并以未知样品运行。图4显示了色谱图，表1的回收率结果表明方法具有极高的精确度。 图4： 10ppb 加标样品通道1(顶部)和3(底部)全色谱图 ■ 结论 开发出了一种测定大麻中真菌毒素的新荧光检测方法。该方法十分灵敏且抗干扰能力强，只需将我们的RF-20AXS 检测器添加到 i-Series LC-2030 即可。 ( 参考文献 ) ( 1) Hazenkamp A. An e v aluation of the quality of medicinal grade cannabis in the Netherlands. ) ( Cannabinoids. 2006； 1 (1)：1-9 . ) 2)Llewellyn G. C.， O'Rear C. E. Examination of fungalgrowth and aflatoxin production on marihuana.Mycopathologia. 1977；62(2)：109-112. 3) Sedmikova M.， Reisnerova H.， Dufkova Z.， Barta l.，Jilek F. Potential hazard of simultaneous occurrence ofaflatoxin B1 and ochratoxin A. Veterinary Medicine-Czech. 2001；46(6)：169-174. 表1： 10ppb 加标样品结果 真菌毒素 浓度(ppb) 回收率(%) 浓度(ppb) 回收率(%) 黄曲霉毒素 G2 8.022 80.22 8.380 83.80 黄曲霉毒素 G1 8.534 85.34 8.958 89.58 黄曲霉毒素 B2 7.901 79.01 8.363 83.63 黄曲霉毒素B1 7.704 77.04 8.044 80.44 赭曲霉毒素A 8.781 87.81 10.925 109.25 本文由美国岛津科学仪器有限公公提供。 ( 岛津企业管理(中国)有限公司 岛津(香港)有限公司 ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考， 不 予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。 ) 黄曲霉毒素和赭曲霉毒素均属于真菌毒素，是曲霉属霉菌物种产生的次生代谢产物。本研究旨在开发一种强大的检测方法，以供大麻检测实验室有效获得低于法规限值的浓度 - 黄曲霉毒素B1、B2、G1 和 G2 合并为 20 ppb，赭曲霉毒素 A 单独为 20 ppb。这是一种测定大麻中真菌毒素的新荧光检测方法。该方法十分灵敏且抗干扰能力强，只需将我们的 RF-20AXS 检测器添加到 i-Series LC-2030 即可。