中药中主要物质含量分析检测方案

15版药典中药材黄曲霉毒素检测方案 免疫亲和柱---光化学柱后衍生法 本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42） 光化学柱后衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器） 荧光检测器检测，激发波长：360nm(365nm) 发射波长：450nm 两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 混合对照品溶液的制备 精密量取PriboFast®STD#1082AFT黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0µg/mL、 0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备溶液。精密量取储备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 供试品溶液的制备 1.取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000转/分,普瑞邦均质器Pribolab® WR800: 转速22,000 r/min）。 2.2500r/min离心5分钟或用槽纹滤纸过滤。 3.精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用PBS溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm,用PriboFast®玻璃微纤维滤纸代替最好，性能较高，效率高）过滤。 4.准确移取20.0mL样品提取液，过PriboFast® 免疫亲和柱，过柱时流速不能快，流速快的话回收效率差，建议采取重力过柱。 5.用PBS溶液20mL洗涤，洗涤液弃去。 6.为保证洗脱充分，建议以2.0mL色谱甲醇分三步进行洗脱，重力洗脱即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脱，当溶剂通过柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇进行洗脱，过柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脱，过柱前孵育30s，并使2-3mL空气通过柱体，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 (免疫亲和柱操作建议使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率) 液相色谱条件（光化学柱后衍生法） 流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42） 柱 温：30 ℃ 进样量：20 μL 激发波长：360 nm；发射波长：450 nm 用PriboFast®KRC光化学柱后衍生器(254nm) 流速： 0.8 mL/min 保留时间:G2: 10 min, G1:12 min, B2:14 min, B1:18min（大约) 用PriboFast®MDU光化学柱后衍生器(254nm) 流速： 1.2 mL/min 保留时间：G2: 3 min, G1:5 min, B2:6 min, B1:9 min（大约) 测定法： 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。 【附注】 （1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。 （2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。 黄曲霉毒素检测药典操作方法：    高效液相色谱-光化学柱后衍生    本法系用高效液相色谱法(通则0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1 和黄曲霉毒素G2 总量计),除另有规定外,按下列方法测定。当测定结果超出限度时,采用第二法进行确认。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷相;采用光化学柱后衍生法检测；    光化学衍生法:光化学衍生器(254nm);以荧光检测器检测,激发波长λex=360nm (或365nm),发射波长λex=450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。    混合对照品溶液的制备： 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2 标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/m1)0.5ml,置10ml 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为储备液。精密量取储备液1ml,置25ml 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得。供试品溶液的制备取供试品粉末约15g (过二号筛),精密称定,置于均质瓶中,加入氯化钠3g,精密加入70%甲醇溶液75ml,高速搅拌2 分钟(搅拌速度大于11000 转/min),离心5 分钟(离心速度2500 转/min),精密量取上清液15ml,置50ml 量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,量取续滤液20.0ml,通过免疫亲合柱,流速每分钟3ml,用水20ml 洗脱,洗脱液弃去,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再用适量甲醇洗脱,收集洗脱液,置2ml 量瓶中,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20~25μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2 的量,计算,即得。混合对照品溶液的制备： 精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml、）0.5ml，置10ml于量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。(Pribolab提供混合标准品)    供试品溶液的制备： 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000转/分,普瑞邦均质器转速达到20000以上），离心5分钟（离心速度2500转/分），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm,用玻璃纤维滤纸代替最好）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(免疫亲和柱操作建议使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率)    测定法： 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。四、黄曲霉毒素毒素检测日常注意事项本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。1、所有疑似被霉菌毒素污染的食品样本都应该小心处理。2、若处理食物样本时真菌孢子飞扬，需用一次性手套和防护面罩进行防护。3、冻干的黄曲霉毒素标准品带有静电，容易吸附，所以处理时需要特别防备，应该在无菌操作台里操作。4、实验后，可用1%漂白水擦拭被黄曲霉毒素污染的地方。次氯酸钠漂白剂（NaClO）擦拭后停留10 分钟，用5%丙酮水溶液擦拭。5、可用甲醇漂洗所有接触了黄曲霉毒素的玻璃器皿，加入1%次氯酸钠溶液，两小时后加入总体积5%的丙酮。30 分钟后，彻底清洗。6、穿过的实验服或者防护服用5%漂白水浸泡。次氯酸钠溶液过夜浸泡之后水洗。7、薄层色谱法（TLC）实验室中有很多易挥发试剂。8、暴露在紫外光下之前需将容器干燥，因为阳光或者荧光灯中的紫外光可以催化形成复合物。这些复合物可以在暴露于紫外光下的吸附性表面被检测到，尤其是在溶剂中。10.避免紫外光照射已形成的菌斑，因为黄曲霉毒素在紫外光下容易降解。11.在日光中充分保护分析材料，保持黄曲霉毒素标准溶液避光，可以通过使用棕色瓶或铝箔纸包裹，并放一个警示标签。12.用无酸的玻璃器皿，因为酸性物质会造成水溶液中黄曲霉毒素的降解。13.在使用前新的玻璃器皿浸泡在稀酸（准确加入105mL H2SO4 在水中定容到1L）中几个小时，然后用蒸馏水将酸类物质冲洗干净。