中成药（特殊食品）中黄曲霉毒素B族和G族检测方案(均质器)

Pribolab青岛普瑞邦生物工程有限公司Pribolab PTE.LTD.致力于食品安全每一天Devoted to Food Safety Every Day 中成药中黄曲霉毒素B族和G；i族的检测解 决方案 关键字： 中成药；；高效液相色谱仪；黄曲霉毒素；免疫亲和柱；固相净化柱介绍： 该方法适用于包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药的黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的高效液相色谱检测。样品经提取、真菌毒素固相净化柱和真菌毒素免疫亲和柱双柱净化后，用高效液相色谱串联光化学柱后衍生器和荧光检测器进行定量分析黄曲霉毒素含量。黄曲霉毒素 G2、B2在1.5~600 pg范围内线性关系良好，相关系数R?> 0.99；黄曲霉毒素 G1、B1在5~2000pg范围内线性关系良好，相关系数R²> 0.99。平均回收率在77.5%~118.9%之间。结果表明，该方法快速准确，回收率高，可最大程度去除杂质干扰，净化样品，可作为包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药中黄曲霉毒素的含量测定方法。 黄曲霉毒素 (aflatoxins)系剧毒物质，能诱发原发性肝癌。黄曲霉毒素不溶于水，耐热性高，一般的水洗、加热炮制等传统中成药制作工艺对其含量影响不大，使用霉变中药材加工饮片及其成药制品极易带入黄曲霉毒素污染。由于中成药成分复杂，含有包括远志、酸枣仁、土鳖虫、蜂蜜、蔗糖在内的多种成分，这对色谱检测起到了很大程度的干扰，单一的净化方式远远不足以将其除掉，难以定性定量分析。本研究建立了一种双重净化的前处理模式，能最大程度地去除复杂成分的干扰，同时使中成药中的毒素得到很好的富集，便于检测。结果表明，该方法在满足操作简单、价格低廉的同时，还能达到低检出限、高稳定性的效果，为中成药中黄曲霉毒素的检测提供一个行之有效的方法。 1.仪器、耗材 高效液相色谱系统包括：岛津SIL-20A|自动进样器，岛津 DGU-20A泵，岛津 RF-20A荧光检测器和 Labsolutions 色谱工作站； Pribolab@ MFC226固相净化柱(Pribolab，普瑞邦)， Pribolab@黄曲霉毒素总量免疫亲和柱(Pribolab， 普瑞邦)；Pribolab@2000S 高速均质器 (Pribolab，普瑞邦)； Pribolab@KRC 光化学柱后衍生器(Pribolab，普瑞邦)； Pribolab@黄曲霉毒素混合标准品(Pribolab，普瑞邦)。 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(30：10：60)为流动相，流速：1.0mLmin-1，进样量20uL；采用柱后光化学衍生法，以荧光检测器检测，激发波长：360nm，发射波长：450nm。 精密吸取混合对照品溶液(黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的浓度分别为300、1000、300、1000 ng* mL-1) 0.5 mL， 置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为混合对照品储备液。精密吸取混及对照品储备液1mL， 置于50 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，，即得混合对照品工作液。 抽取脑立清丸、乌鸡白凤丸、六味地黄丸、人参养荣丸、人参健脾丸、大黄蛰虫丸、百令胶囊和金水宝胶囊进行方法验证。精密吸取混合标准品溶液25L，加标水平为黄曲霉毒素 B1、Gi 5 ug/kg， 黄曲霉毒素 B2、G2 1.5 ug/kg.制备供试品溶液，进液相色谱分析，记录峰面积，，计算回收率(见表1)。 表18种中成药回收率及精密度 Table 1 Recovery Rate and Precision of Eight Chinese Patent Medicines 项目 黄曲霉毒素G回 黄曲霉毒素G 黄曲霉毒素B， 黄曲霉毒素B 收率及 RSD/% 回收率及 RSD/% 回收率及 RSD/% 回收率及 RSD/% 78.5 90.5 98.0 97.8 脑立清丸 77.5 3.8 81.8 6.6 90.5 4.1 109.4 6.1 83.2 93.0 92.7 99.5 95.4 105.6 105.9 102.5 乌鸡白凤丸 80.2 9.1 94.5 5.8 100.0 2.9 116.1 6.3 92.7 97.3 102.3 108.2 普瑞邦(青岛)：0532-84670748 普瑞邦官网： www.pribolab.com Pribolab PTE.LTD. 85.5 79.5 87.5 81.5 六味地黄丸 85.9 2.3 81.8 2.2 85.1 2.0 90.2 5.4 82.3 83.1 88.5 83.4 100.7 109.5 105.8 118.5 人参健脾丸 105.1 2.2 109.5 2.7 110.2 4.7 114.5 3.6 103.8 104.4 100.3 110.2 100.0 115.5 110.2 116.8 人参养荣丸 105.7 4.5 108.1 8.7 105.8 2.5 109.6 7.8 109.4 97.0 105.4 99.8 118.9 117.9 104.4 106.5 大黄蛰虫丸 94.2 14.2 105.9 10.1 94.1 6.7 109.0 2.2 93.3 96.4 92.3 104.3 105.3 108.2 105.6 110.9 百令胶囊 95.5 5.0 99.3 4.4 105.4 4.3 106.5 3.5 102.9 102.5 97.8 103.5 110.3 108.9 105.3 108.5 金水宝胶囊 90.0 11.1 109.5 3.7 105.8 6.7 101.6 5.1 93.6 102.4 93.7 98.2 5.结果分析 本方法主要是采用复合的净化手段，即先过固相净化柱，除去脂肪蛋白类、色素类、添加剂、糖类以及结构相似的香豆素类成分，再用免疫亲和柱进行净化，高特异性吸附黄曲霉毒素，采用专用的淋洗液，达到最佳净化富集效果，通过液相色谱串联光化学衍生器和荧光检测器定性定量分析。该方法操作简单快捷，成本低，重复性好，通用性强，适用于多种中成药中黄曲霉毒素的检测。 产品名称 规格 货号 液相色谱柱MycoChrm Ci8 5um 4.6*150 185150 黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 25T(3mL) IAC-011-3 普瑞邦官网： www.pribolab.com 黄曲霉素BjB2GiG2混标 1.0ug/mLB1，Gi； STD#1082 0.3ug/mLB2，G2 中药材中黄曲霉毒素* >10 ppb(高中低) MRM-AF 泵流操作架 亲和柱批量操作 EQ-RACK 8/12 Muti-Prep 2000S MP 2000 全自动多样品均质器 光化学衍生器KRC KRC-II *此类为自然污染物质，每批次供应量有限，不同批次产品浓度不同。 微信公众平台 Pribolab 生物 官网 www.pribolab.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知! 普瑞邦官网： www.pribolab.com 地址：山东省青岛市高新区广博路服务热线： MAX商务红湾楼普瑞邦(青岛)：真： 地址：山东省青岛市高新区广博路MAX商务红湾楼服务热线：传专真： 中成药中黄曲霉毒素B族和G族的检测解决方案关键字：中成药；高效液相色谱仪；黄曲霉毒素；免疫亲和柱；固相净化柱介绍：该方法适用于包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药的黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的高效液相色谱检测。样品经提取、真菌毒素固相净化柱和真菌毒素免疫亲和柱双柱净化后，用高效液相色谱串联光化学柱后衍生器和荧光检测器进行定量分析黄曲霉毒素含量。黄曲霉毒素G2、B2在1.5 ~ 600 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99；黄曲霉毒素G1、B1在5 ~ 2 000 pg范围内线性关系良好，相关系数R2 ＞ 0.99。平均回收率在77.5% ~ 118.9%之间。结果表明，该方法快速准确，回收率高，可最大程度去除杂质干扰，净化样品，可作为包含水丸、水蜜丸、大蜜丸、胶囊和浓缩丸在内的多种中成药中黄曲霉毒素的含量测定方法。前言黄曲霉毒素（aflatoxins）系剧毒物质，能诱发原发性肝癌。黄曲霉毒素不溶于水，耐热性高，一般的水洗、加热炮制等传统中成药制作工艺对其含量影响不大，使用霉变中药材加工饮片及其成药制品极易带入黄曲霉毒素污染。由于中成药成分复杂，含有包括远志、酸枣仁、土鳖虫、蜂蜜、蔗糖在内的多种成分，这对色谱检测起到了很大程度的干扰，单一的净化方式远远不足以将其除掉，难以定性定量分析。本研究建立了一种双重净化的前处理模式，能最大程度地去除复杂成分的干扰，同时使中成药中的毒素得到很好的富集，便于检测。结果表明，该方法在满足操作简单、价格低廉的同时，还能达到低检出限、高稳定性的效果，为中成药中黄曲霉毒素的检测提供一个行之有效的方法。1. 仪器、耗材高效液相色谱系统包括：岛津SIL-20A 自动进样器，岛津DGU-20A泵，岛津RF-20A荧光检测器和Labsolutions色谱工作站；Pribolab® MFC226固相净化柱（Pribolab，普瑞邦），Pribolab®黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®2000S高速均质器（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®KRC光化学柱后衍生器（Pribolab，普瑞邦）；Pribolab®黄曲霉毒素混合标准品（Pribolab，普瑞邦）。2. 液相条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（30：10：60）为流动相，流速：1.0 mL·min-1，进样量20 uL；采用柱后光化学衍生法，以荧光检测器检测，激发波长：360 nm，发射波长：450 nm。3. 标准曲线配制精密吸取混合对照品溶液（黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的浓度分别为300、1000、300、1 000 ng·mL-1）0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液1 mL，置于50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得混合对照品工作液。4. 方法验证抽取脑立清丸、乌鸡白凤丸、六味地黄丸、人参养荣丸、人参健脾丸、大黄蛰虫丸、百令胶囊和金水宝胶囊进行方法验证。精密吸取混合标准品溶液25 μL，加标水平为黄曲霉毒素B1、G1  5μg/kg，黄曲霉毒素B2、G2  1.5μg/kg。制备供试品溶液，进液相色谱分析，记录峰面积，计算回收率（见表1）。表1 8种中成药回收率及精密度Table 1   Recovery Rate and Precision of Eight Chinese Patent Medicines项目黄曲霉毒素G2回收率及RSD/%黄曲霉毒素G1回收率及RSD/%黄曲霉毒素B2回收率及RSD/%黄曲霉毒素B1回收率及RSD/%脑立清丸78.53.8 90.56.6 98.04.1 97.86.1 77.581.890.5109.483.293.092.799.5乌鸡白凤丸95.49.1 105.65.8 105.92.9 102.56.3 80.294.5100.0116.192.797.3102.3108.2六味地黄丸85.52.3 79.52.2 87.52.0 81.55.4 85.981.885.190.282.383.188.583.4人参健脾丸100.72.2 109.52.7 105.84.7 118.53.6 105.1109.5110.2114.5103.8104.4100.3110.2人参养荣丸100.04.5 115.58.7 110.22.5 116.87.8105.7108.1105.8109.6109.497.0105.499.8大黄蛰虫丸118.914.2 117.910.1 104.46.7 106.52.2 94.2105.994.1109.093.396.492.3104.3百令胶囊105.35.0 108.24.4 105.64.3 110.93.5 95.599.3105.4106.5102.9102.597.8103.5金水宝胶囊110.311.1 108.93.7 105.36.7 108.55.1 90.0109.5105.8101.693.6102.493.798.25.  结果分析本方法主要是采用复合的净化手段，即先过固相净化柱，除去脂肪蛋白类、色素类、添加剂、糖类以及结构相似的香豆素类成分，再用免疫亲和柱进行净化，高特异性吸附黄曲霉毒素，采用专用的淋洗液，达到最佳净化富集效果，通过液相色谱串联光化学衍生器和荧光检测器定性定量分析。该方法操作简单快捷，成本低，重复性好，通用性强，适用于多种中成药中黄曲霉毒素的检测。6. 配置方案产品名称规格货号液相色谱柱MycoChrm C18 5μm 4.6*150185150黄曲霉毒素总量免疫亲和柱25T（3mL）IAC-011-3黄曲霉素B1B2G1G2混标1.0µg/mLB1,G1;0.3µg/mLB2,G2STD#1082中药材中黄曲霉毒素*>10 ppb（高中低）MRM-A-SF泵流操作架亲和柱批量操作EQ-RACK 8/12Muti-Prep 2000S全自动多样品均质器——MP 2000光化学衍生器KRC KRC-II*此类为自然污染物质，每批次供应量有限，不同批次产品浓度不同。          本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知！