中药材中黄曲霉毒素检测方案(通用色谱配件)

引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 液相色谱柱后碘衍生法和柱后光衍生法检测中药材中的黄曲霉毒素 摘要：采用液相色谱柱后碘衍生法和柱后光衍生法检测中药材中的黄曲霉毒素，比较了两者的线性、重复性、检测限、回收率，并应用于实际样品柏子仁的分析。两者的线性、重复性、检测限、回收率均良好且相似，均可用于中药材中黄曲霉毒素的检测。 关键词：柱后碘衍生法 柱后光衍生法黄曲霉毒素 中药材 本文同时采用柱后碘衍生法和柱后光衍生法检测中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，并对分析结果进行比较。 1实验部分 1.1仪器与试剂 1.1.1液色色谱系统 LC-10ADvp (输液泵)，DGU-14A(在线脱气机)，FCV-10Avp(低压梯度单元)， SIL-HTC(自动进样器)， CTO-10Avp (柱温)， RF-10AXL(荧光检测器)， SCL-10Avpp(系统控制器)， LCsolution(色谱工作站)。 1.1.2柱后衍生系统 柱后碘衍生系统：LC-10ADvp(衍生泵)， CRB-6A(化学反应箱)，碘衍生柱后反应管套件，包括：：三通接头，衍生管(PTFE 0.5 mm I.D.×1000 cm L.)； 柱后光化学衍生装置， AURA公司，内置反应管(PTFE 0.5 mm I.D.×1500 cm L.)。 1.1.3其它设备和试剂 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 Alfa test 免疫亲和柱，，VICAM公司；玻璃纤维滤纸，VVICAM公司；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混标溶液， Supeclo 公司；甲醇， HPLC 级， Merck 公司；乙腈， HPLC 级，Merck 公司；纯水， Millipore 纯水机制得。 1.2标准品溶液的配制及样品前处理 标准溶液配制：黄曲霉毒素混标原溶液(B1，G1：1.0 mg/L； B2，G2： 0.30 mg/L)， 经流动相稀释，配制标准溶液浓度系列。 前处理步骤：取中药材粉末约5 g(过二号筛，精确到 0.01g)， 置于锥形瓶中。精确加入60%甲醇溶液50mL， 往复振荡60 min。精确量取上清液5mL， 置于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤纸过滤。量取滤液25 mL， 通过免疫亲和柱，流速控制约1~2滴/秒。用水10 mL洗脱，洗脱液弃取，使空气进入柱子，将水挤出柱子。再用1mL甲醇，流速控制1滴/秒，收集洗脱液，置于2mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.45 um 滤膜过滤，待测。 1.3分析条件 1.3.1碘衍生分析条件液相分离条件流速：0.3 mL/min流动相：乙腈/甲醇/水=20/25/55(v/v)衍生化温度：70℃流 速：0.8mL/min1.3.2光衍生分析条件色谱柱： Intersil ODS-3 4.6×250 mm， 5流动相：乙相/甲醇/水=25/25/50(v/v)um流 速：0.8mL/min柱 温：40℃色谱柱： Intersil ODS-3 4.6×250 mm， 5进样体积：50pLum检测波长： Ex=360nm，Em=440 nm柱 温：40℃柱后衍生条件进样体积：50uL衍生溶液：0.05%碘溶液(取0.5g，加入检测波长： Ex=360nm， Em=440nm甲醇100 mL， 用水稀释至1000 mL) 2结果与讨论 2.1线性范围及检出限 黄曲霉毒素混标进样液相色谱检测，碘衍生和光衍生法所得图谱如下图1、2所示。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：4006165163 图1.碘衍生法混标溶液色谱图 (G2：1.5ng/mL； G1 ： 5.0 ng/mL； B2 ： 1.5 ng/mL； B1 ： 5.0 ng/mL) 图2.光衍生法混标溶液色谱图 (G2： 1.5ng/mL； G1： 5.0 ng/m；B2：1.5 ng/mL； B1：5.0ng/mL) 以B1、G1浓度分别为0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 ng/mL； B2、G2浓度分别为 0.06、0.15、0.30、0.60、1.5 ng/mL 混标溶液，分别采用碘衍生和光衍生方法制作校准曲线，并进行比较，标准曲线图如图3-图6，标准曲线方程见表1。 图3.黄曲霉毒素 G2 的校准曲线 图4.黄曲霉毒素G1 的校准曲线 图5.黄曲霉毒素 B2的校准曲线 图6.黄曲霉毒素B1的校准曲线 表1.标准曲线方程 碘衍生法 光衍生法 组分 Y=AX+B R 组分 Y=AX+B R G2 Y=98842X+405 0.999 G2 Y=137928X+631 0.999 G1 Y=90366X+728 0.999 G1 Y=59694X+1251 0.999 B2 Y=215544X+2432 0.999 B2 Y=299943X+318 0.999 B1 Y=158510X+5598 0.999 B1 Y=116411X+2161 0.999 四种AF 的检出限和定量限，见表2。 表2.四种AF 的检出限(LOD)与定量限(LOQ) 碘衍生法 光衍生法 组分 LOD LOQ 组分 LOD LOQ (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) G2 0.070 0.23 G2 0.028 0.09 G1 0.093 0.31 G1 0.065 0.21 B2 0.032 0.11 B2 0.015 0.05 B1 0.052 0.17 B1 0.041 0.14 2.2精密度实验 表3.精密度实验结果(n=3) 组分 碘衍生法 光衍生法 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 RSD% RSD% RSD% RSD% G2 0.04 0.66 0.04 0.51 G1 0.04 0.62 0.06 0.57 B2 0.07 0.39 0.06 0.20 B1 0.05 0.84 0.07 0.22 2.3样品分析 按照1.2所述方法处理柏子仁样品，检出B2、B1，样品色谱图见图7、8，检测结果见 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 表4. 图7.碘衍生法样品色谱图 图8.光衍生法样品色谱图 表4.样品分析结果 组分 碘衍生 光衍生 浓度 含量 浓度 含量 (ng/mL) (ug/kg) (ng/mL) (ug/kg) G2 G1 B2 0.32 2.53 0.31 2.49 B1 2.21 17.67 2.15 17.18 2.4回收率实验 按照上述方法处理空白黄芪样品，样品加标色谱图见图9、10。样品加标回收率在80.0%~104.6%之间，回收率结果见表5和表6. 图9.碘衍生样品加标色谱图 图10.光衍生样品加标色谱图 表5.碘衍生回收率结果 组分 加标量(ug/kg) 回收率% G2 104.6 G1 10 103.9 B2 3 90.0 B1 10 86.5 表6.光衍生回收率结果 组分 加标量(ug/kg) 回收率% G2 3 97.4 G1 10 93.2 B2 3 91.4 B1 10 80.0 3结论 本文分别采用液相色谱柱后碘衍生法和柱后光衍生法对中药材中的黄曲霉毒素进行检测。两种方法的相关系数 R 均为0.999以上，保留时间和峰面积重现性均良好，回收率在80.0~104.6%之间，且两者对阳性样品分析的结果一致。碘衍生法和光衍生法均可用于中药材中黄曲霉毒素的检测。 碘衍生分析条件流 动 相：乙腈/甲醇/水＝20/25/55 (v/v)流 速：0.8 mL/min色 谱 柱：Intersil ODS-3 4.6×250 mm, 5um柱 温：40℃进样体积：50uL检测波长：Ex=360 nm，Em＝440 nm光衍生分析条件流 动 相：乙腈/甲醇/水＝25/25/50 (v/v)流 速：0.8 mL/min色 谱 柱：Intersil ODS-3 4.6×250 mm, 5um柱 温：40℃进样体积：50uL检测波长：Ex=360 nm，Em＝440 nm