酸枣仁中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 高效液相色谱碘柱后衍生法测定中药材酸枣仁中的黄曲霉毒素 摘要：本文使用岛津LC-20A 液相色谱仪柱后衍生系统建立了碘柱后衍生荧光检测法测定中药材酸枣仁中黄曲霉毒素 G2， G1， B2， B1 的方法。G2、B2在 0.006~1.50ug/mL的浓度范围内标准曲线的线性相关系数在 0.9999，线性关系良好。G1、B1在 0.20~5.00ug/L 的浓度范围内标准曲线的线性相关系数在 0.9999， 线性关系良好。对 G2 和B2浓度为 0.3ug/L， G1和B1浓度为 1.0ug/L 的六个平行标准品进行分析，重复性结果(RSD%表示)： G2的保留时间 RSD 为 0.02%， 峰面积 RSD 为0.6%； G1的保留时间 RSD 为 0.02%，峰面积 RSD 为0.6%； B2的保留时间 RSD 为 0.04%， 峰面积 RSD 为 0.6%； B1的保留时间 RSD 为 0.03%，峰面积 RSD 为0.6%，结果的重复性良好。 关键词：：酸枣仁 黄曲霉毒素 G2， G1， B2， B1 碘柱后衍生 黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。 本实验应用岛津高效液相色谱LC-20A柱后衍生系统建立了一种对黄曲霉毒素G2， G1，B2， B1的碘柱后衍生荧光检测方法，并应用于酸枣仁样品的分析。 黄曲霉毒素 G2的化学结构式 黄曲霉毒素B2的化学结构式 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 1实验部分 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 甲醇： HPLC级 水：超纯水。 黄曲霉毒素混标储备液：精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 G2， G1， B2， B1标示浓度分别为 0.3ug/mL， 1.0ug/mL， 0.3ug/mL， 1.0ug/mL)1mL， 置10mL量瓶中，E甲醇稀释至刻度，作为储备液。 1.1.2仪器 LC-20A 液相系统，包括 CBM-20A系统控制器，LC-20AD 高精度溶液输送泵×3，DGU-20A5在线脱气机， SIL-20AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CRB-6A 柱后衍生反应箱， RF-20A荧光检测器。 1.2分析条件 色谱柱： IntersilODS-34.6×250mmL， 5um 流动相：A一水，B一甲醇， A/B=47/53 (v/v)； 流速： 1.0mL/min： 洗脱方式： 等度洗脱 柱温：40℃； 荧光检测波长：激发波长Ex=350nm， 发射波长Em=450nm； 进样量：25pL。 柱后衍生条件： 衍生试剂：0.05%碘溶液(取0.5g，加入100mL甲醇，超纯水定容至1000mL) 流速： 0.3mL/min 衍生化温度：70℃ 1.3样品处理 1.3.1黄曲霉毒素混合标准品的配制 取不同量的黄曲霉毒素储备液，用甲醇稀释，配制成浓度为 G2， B2 浓度为0.006，0.012，0.30， 0.60和1.50 ug/L的标准系列； G1，B1浓度为0.2，0.4，1.0， 2.0，5.0 ug/L的标准系 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 列，储存在棕色小瓶中，于4℃冰箱中存放。 1.3.2试样的制备 取供试品粉末约 10g，精确称定，加入氯化钠2g。精确加入70%甲醇溶液100 mL， 超声处理20分钟，离心5分钟(离心速度8000转/分)。精确量取上清液10mL， 置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精确量取25 mL， 通过免疫亲和柱，流速每分钟2-3 mL，用水5mL淋洗，洗液弃去，使空气进入柱子，再用甲醇1.4mL分2次洗脱，收集洗脱液，用水定容至2mL， 即得。 2结果与讨论 2.1黄曲霉毒素标准谱图及标准曲线 图1.黄曲霉毒素混合标准品 10.0 ug/L 的色谱图 图2.五个不同浓度的黄曲霉毒素混合标准品的色谱图 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 1.00 b=5.480e-003 R=0.9999 b=1.882e-002R=0.9999 2.2方法的重复性 为了进一步考察该方法的重复性，本文分别对G2和B2浓度为0.60 ug/L， G1和B1浓度为2.0 ug/L的黄曲霉毒素混合标准样品进行了6次重复实验，重复性结果(RSD%表示)： G2的保留时间RSD为0.02%，峰面积RSD为0.60%，G1的保留时间RSD为0.02%，1峰面积RSD为0.60%，B2的保留时间RSD为0.04%，峰面积RSD为0.60%，B1的保留时间RSD为0.03%，峰面积RSD为0.60%，结果汇总如下表。 表1.黄曲霉毒素 G20.6ug/L， G1 2.0ug/L 标准溶液的保留时间和峰面积重复性 No. 保留时间(min) 峰面积 物质 G2 G1 G2 G1 数据1 10.614 12.761 30284 70179 数据2 10.619 12.764 29966 70407 数据3 10.619 12.765 30108 70796 数据4 10.614 12.759 30457 70247 数据5 10.615 12.762 30333 70772 数据6 10.615 12. 761 30361 71544 平均 10.616 12.762 30252 70658 RSD% 0.02 0.02 0.60 0.60 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 表2.黄曲霉毒素B2 0.6pg/L， B1 2.0ug/L标准溶液的保留时间和峰面积重复性 No. 保留时间(min) 峰面积 物质 B2 B1 B2 B1 数据1 15.255 18.732 51895 113102 数据2 15.266 18.737 52588 111836 数据3 15.268 18.737 5267 112187 数据4 15.255 18.724 52853 111267 数据5 15.261 18.735 52684 112924 数据6 15.251 18.723 52936 112004 平均 15.259 18.731 52605 112220 RSD% 0.04 0.03 0.60 0.60 3.样品分析 按照1.3.2所述步骤处理酸枣仁样品，检测出黄曲霉毒素G1，G2， B1， B2，结果见表3。图7为酸枣仁样品色谱图。图8为G1、B1加标0.75ug/L，，G2、B2加标2.5ug/L的色谱图。 图7.酸枣仁样品色谱图 图8.酸枣仁样品加标图 表3.酸枣仁样品加标回收率表 物质 浓度(ug/L) 加标量(ug/L) 实测浓度(ug/L) 回收率% G2 0.032 0.75 0.747 95.33 G1 0.043 2.50 2.435 95.68 B2 0.046 0.75 0.714 89.07 B1 0.084 2.50 2.430 93.84 为考察方法的灵敏度，对浓度为 0.06 ug/L 的标准品进行分析，得到色谱图如图9所示，此时信噪比为 G2： 15.852， G1： 33.062， B2： 21.457， B1：38.481。经计算得到此分析方法的检出限，定量限见表4。 ) 图9.浓度为 0.06 ug/L标准品的色谱图 表4.黄曲霉毒素仪器检出限和定量限 物质 检出限(ug/L) 定量限(ug/L) 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) G2 0.011 0.038 0.002 0.008 G1 0.005 0.018 0.001 0.004 B2 0.008 0.028 0.002 0.006 B1 0.004 0.015 0.001 0.003 4结论 本实验中使用 LC-20A柱后衍生系统，开发了中药材酸枣仁中黄曲霉毒素 G2， G1， B2， B1的碘柱后衍生检测方法。本法具有快速，线性、重复性好和灵敏度高等优点。 色谱柱：Intersil ODS-3 4.6×250mm，5μm流动相：A－水，B－甲醇， A/B=47/53 (v/v)；流速：1.0 mL/min；洗脱方式：等度洗脱柱温：40℃；荧光检测波长：激发波长Ex=350nm，发射波长Em=450nm；进样量：25μL。柱后衍生条件：衍生试剂：0.05%碘溶液（取0.5g，加入100mL甲醇，超纯水定容1000mL）流速：0.3mL/min衍生化温度：70℃