末知蛋白质溶液中蛋白质含量检测方案(定氮仪)

来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 蛋白质含量的测定方法 C 一、：实验原理 考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后后色由红色形式转变蓝色形式，最大光吸收由465nm 变成 595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 (Beer’slaw) ， 因此可以通过测定染料在 595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100ug蛋白质。 由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。 二、实验用品 (一)器材 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 景盛南二街33号4号楼4层 (1)722分光光度计。 (2)微量进样器。 (3)移液管(0.1ml及5ml)。 (4) 试管及试管架。 (二)试剂 (1)标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白 OD1%1cm=6.6测定蛋白质含量，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml 蛋白质溶液。 (2)考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250100mg 溶于 50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml， 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝 G-250， 4.7% (W/V) 乙醇，8.5%(W/V)磷酸。 (三)材料 末知蛋白质溶液，要求蛋白质浓度范围为 0.1~5mg/ml， 若浓度过度时，需用 0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。 三、实验程序 (一)操作方法 1.标准法制作标准曲线 取14支试管，分两组按表1-1平行操作。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 表1-1 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 标准含量/ug 0 10 20 30 40 50 60 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 考马斯亮蓝试剂/崭 5ml 摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 以OD595为纵坐标，标准蛋白为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 2.微量法制作标准曲线 取12支试管，分两组按表1-2平行操作。 表1-1 试管编号 0 1 2 3 4 5 标准含量/ug 0 1 3 5 7 9 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.15mol/L NaCl 0.10 0.09 0.07 0.05 0.03 0.01 考马斯亮蓝试剂/崭 1ml 摇匀，1h内以0号试管为空白对照， 在595nm处比色 3.末知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上，取合适的末知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的 OD595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出末知样品的蛋白质浓度(mg/ml)。 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 北京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地 京来亨科学仪器有限公司技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 一、实验原理考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law），因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100µg蛋白质。由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。 二、实验用品(一)器材    (1) 722分光光度计。    (2) 微量进样器。    (3) 移液管（0.1ml及5ml）。(4) 试管及试管架。   （二）试剂     (1)标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6测定蛋白质含量，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白质溶液。     (2)考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。    (三)材料         末知蛋白质溶液，要求蛋白质浓度范围为0.1~5mg/ml，若浓度过度时，需用0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。   三、实验程序  （一）操作方法   1.标准法制作标准曲线    取14支试管，分两组按表1-1平行操作。