考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式,红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law),因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100μg蛋白质。
考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式,红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law),因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100µg蛋白质。 由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量测定。 二、实验用品 (一)器材 (1) 722分光光度计。 (2) 微量进样器。 (3) 移液管(0.1ml及5ml)。 (4) 试管及试管架。 试剂 (1)标准蛋白质溶液:结晶牛血清白蛋白,预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6测定蛋白质含量,再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白质溶液。 (2)考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)磷酸。 (三)材料 末知蛋白质溶液,要求蛋白质浓度范围为0.1~5mg/ml,若浓度过度时,需用0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。 实验程序 (一)操作方法 1.标准法制作标准曲线 取14支试管,分两组按表1-1平行操作。 表1-1 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白含量/µg 0 10 20 30 40 50 60 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.15mol/L NaCl/ml 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考马斯亮蓝试剂/ml 5ml 揺匀,1h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色 OD595 以OD595为纵坐标,标准蛋白为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。 2.微量法制作标准曲线 取12支试管,分两组按表1-2平行操作。 表1-2 试管编号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白含量/µg 0 1 3 5 7 9 0.1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.15mol/L NaCl/ml 0.10 0.09 0.07 0.05 0.03 0.01 考马斯亮蓝试剂/ml 1ml 揺匀,1h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色 OD595 3.末知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上,取合适的末知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内,根据所测定的OD595值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出末知样品的蛋白质浓度(mg/ml)。 PAGE 1 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心:北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心:北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量 一、实验原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式,红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law),因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100μg蛋白质。由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量测定。 二、实验用品(一)器材 (1) 722分光光度计。 (2) 微量进样器。 (3) 移液管(0.1ml及5ml)。 (4) 试管及试管架。
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