动物中睡眠分析检测方案(行为研究仪器)

中国药理学通报 Chinese Pha macojgical Bu lletjnn2008 Jan24(1)： 20~320° 小鼠睡眠生物解析系统与应用 邱梅红，岳小芳，徐昕红，黄志力' (复旦大学上海医学院1医学神经生物学国家重点实验室、2药理学系，上海 200032) 中国图书分类号：R-3322R 284 1； R-33863 R 392 11R 741. 044 文献标识码：A文章编号：1001-1978(2008)01-0020一04摘要：目的 建立高度自动化小鼠睡眠生物解析系统，并考察作用于多巴胺 D/D受体的左旋千金藤啶碱(Lstepholidine SPD)对垂鼠睡眠的影响。方法 动物饲养在恒温、恒湿、隔音、静电屏蔽、12 h/12 h明暗光照环境下，利用‘SleepSign软件，连续48h记录自由运动小鼠的脑电和肌电，分别在 d12：00点腹腔注射生理盐水和 d2同一时间注射 SH并用此软件对脑电和肌电进行分析，自动判断睡眠一觉醒时相。结果 该系统能高度自动化和高效率地记录与解析小鼠睡眠 -觉醒行为。小鼠觉醒期腹复注射 SPD能增加睡眠量，延长非快动眼睡眠波的时程，降低觉醒量及觉醒期脑电波的强度，但不影响快动眼睡眠。结论 作用于多巴胺受体的SPD能促进非快动眼睡眠，抑制觉醒。 关键词：睡眠；脑电图；肌电图； Lstepholiding多巴胺受体拮抗剂 以失眠为主的睡眠障碍正成为日益严重的社会及医学问题。由于国内缺乏长时间记录自由活动动物睡眠一觉醒行为的设备，限制了我国睡眠医学基础研究的发展。例如，我国新药临床前药理实验中，睡眠效应通常以能否延长或缩短苯巴比妥引起的动物翻正反射的丢失时间来反映，所得结果是受试药对麻醉作用的影响，并非对睡眠的直接作用。因此，建立高度自动化的睡眠研究平台，对加强睡眠医学基础研究，探索睡眠障碍的发病机制，开发生理性睡眠调节物质，具有重要意义。我室从日本引进了具有世界先进水平的睡眠生物解析系统，能长时间连续记录自由活动大鼠或小鼠的脑电波( electroencephalogramEEG)与肌电波(electromyogramEMG)， 通过计算机软件：SleepSign( K issei Comtec ( 收稿日期：2007 7--08- 02修回日期：2007 10 15 ) ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(No30570581， 30625021)；上海市浦江计划资助项目(N006PJ4008) ) ( 作者简介：邱梅红(1973一)，女，博士，讲师，研究方向：睡眠与失眠 机制，Te：l021-54237479 Emailmh9iu@ h mu edu c n 黄志力(1962一)男，研究员，博士生导师研究方向：睡 眠与失眠机制，Tel 0 2 1-54237479 E mail huangzl@ f u ldan edu cn ) Nagano japan)客观地评判实验动物睡眠的质和量。现将这一系统和实验方法简介如下，并用此系统观察与多巴胺D和D受体具有高度亲和力的生物碱——左旋千金藤啶碱(L sepholi ne SPD)对小鼠睡眠的影响。 睡眠生物解析系统 小鼠睡眠记录系统主要由动物饲养笼、多通道万向轮( Slp ring Air Precision France)介导的电信号传导系统、电信号过滤及放大器、数据处理及记录系统、红外线监测器及微量注射器等部分组成，具有实时、安全、高效、急定、自动给药、自动记录与分析等特点(Fi81A)。该系统通过植于动物颅骨一脑表面和颈项肌的电极，将大脑细胞群自发性、节律性电活动和颈部肌肉的电活动，经过滤、放大后，通过计算机软件 SleepSign将其转化为肉眼可见的波形，并同步记录下来；记录结束后，再利用 SleepSi8n分析软件自动进行睡眠时相的判定，结合对睡眠波频率和强度的分析，获得睡眠时间、各波的出现次数和强度等数据(Fig1B)由此科学地判断睡眠的质与量.该系统饲养笼具有恒温(22±0.5)℃、恒湿(60±2)%、隔音、静电屏蔽和光控等功能。红外线监测系统可在记录 EEG/EMG的同时，记录动物活动及异常反应等行为。微量注射器可在不打扰动物的情况下，进行脑室或神经核团给药。 根据 EEG/EMG的波幅及频率，睡眠一觉醒时相分为觉醒(wake W)、慢波睡眠 ( slow wave sleepSWS或非快动眼睡眠(non rapid eye movementsleep NREM)、快动眼睡眠( rapia eye movem entsleep REM)。各时相的判定标准1~3是： W EEG以不规则低幅高频信号为主， EMG高度活动；NREM EEG以高幅低频 Delta(0.25~4Hz)信号为主， EMG表现为静止或有轻度活动； REM EEG以低幅高频 Thea(5~9Hz)信号为主， EMG表现为完全静止。软件能显示 EEG经傅立叶转换的FFT直，帮助判别 EEG的频率。 2实验方法 21 材料 21.11动物 C57BL/6J小鼠，，22~26由中国科学院上海实验动物中心提供。分笼饲养，12 Fg1 Diagra show ing the sleep_wake recording syste (A) andautomatjc assgn jing vigilance stages on the basis of EEG/EMG byS leepSign so ftw are(B). W.Wake S nonREM R REM 21.2 药品 SPD由中国科学院上海药物研究所提供；戊巴比妥钠(国药化学试剂有限公司)牙托粉和牙托水上海张江生物材料有限公司) 21.3 仪器 脑立体定位仪(Narishige日本)，睡眠生物解析系统(Bioexkyoto日本)。 222方法 221小鼠头部电极埋植手术 戊巴比妥钠(50mgkg， iP)麻醉小鼠。将小鼠头部手术区剃毛，固定于脑立体定位仪。手术区皮肤消毒后，剪开颅顶皮肤，剥离皮下组织，暴露颅骨。于前/后囟前1.0mm右侧旁开1.5mm两处钻孔(钻通颅骨，但未触及脑组织)，将与采集脑电电极相连的螺丝钉固定于颅骨的钻孔中，用牙托粉将电极封固于颅骨上。另外两根采集肌电的电极埋藏于颈部肌肉内。缝合创口，术后腹腔注射抗生素，恢复7~10d后用于实验记录3~5 222 SPD溶液的制备 用0.1mmol的HSQ先进行溶解解化，然后用0.1mmol.。LNaoH调jPH值至 5.0最后用生理盐水稀释至所用浓度。 223 数据记录 将动物置于睡眠记录系统的饲养笼内，连接记录系统。EEG和 EMG信号通过小鼠头部电极，途经多通道万向轮，经初步放大后再由记录导线将信号接入到放大器。信号经滤波(EEG 0.5~30 HZ EMG 20~200 Hz后，进一步放大，输入到电脑，经模数转换最终获得数字信号。动物适应环境3d后，用 SleepSii软件记录 EEG/EMG4。 记录从19.00点开始，到 d31900点结束，连续48h于d121：00腹腔注射生理盐水 20mlk8作自身对照，d221： 00 腹腔注射 SPD40 mg.kgl 224 数据分析 记录结束后，运用Slepsign分析软件进行数据处理。首先，按不同的实验要求将整个记录数据以4.10或20炸为分析单元，根据记录的」EEG的特征，对分析单元中的Theta波和Delt波波幅和频率检测范围进行预先设定。Theta波波幅范围的确定：先在 EEG中找到一个典型的REM波， FFT值在7H左右，用软件提供的测量器确定定的最大波幅(Amp max)将 Amp max的1/10值作」为 Theta丁检测值 ( detect level， 其频率范围设为5~9 HDelta波波幅范围的确定：根据Theta的 Ampmax值来确定 Delta波的可检测值，原则上高出 Thet波 Amp max的 20%，Delt波上限不限，其频率范围设定为 0.25~4H然后，设定分析单单元 Thet成分与 Delta成分所占的百分比及肌电大小的范围，以界定睡眠一觉醒的不同时相。完成以上设定后，对记录的 EEG/EMG进行全程自动扫描，并自动判定睡眠时相。扫描结束后，即可获得 WNREM REM各时相的时间、各波的出现次数和强度等数据。 225 统计学处理 实验数据用均数*士表示，采用成对检验。 3实验结果 3.1 SPD增加小鼠 NREM睡眠量，降低觉醒 与生理盐水自身对照组比较，小鼠 SPD40mg. kgip后第2小时起，W量减少， NREM睡眠增加，持续近3b给药4h后 NREM睡眠量不再增加，但仍高于基础水平(FB2 A).REM无改变。将给药后6h内各时相时间累加，结果显示：与对照相比，SPD降低给药动物夜间的觉醒量，增加 NREM睡眠量，但对白天各时相无影响(Fi82B)。 3.2 SPD对睡眠时相转换及睡眠时程的影响 如图(Fig3A)所示，和对照组比较， SPD增加NREM睡眠时程在30~60560~120$240~480吸480 ~960的睡眠波出现次数，即SPD增加了上述时程NREM睡眠波出现的次数，延长了 NREM睡眠时间。但给药后，对各时相转换的次数无影响(Fi3B). 3.3 SPI对 EEG能量强度( pow erdensity)的作 一9 Fg2 Sleep_stage distribu tjon producedby SPD i adm injstratjon to m ice A Tie courses of the sleep_wake piofiles after ip adm jn jstratjon ofSPDB Total tie spent inW ake REM andNREM sleep for6 h after SPD adm jin ista tjon( n=4 * R0. 05 vs vehicle) F3 Effects of SPD ip adm injstratjon on sleep episodes sleep_wake state transitionsandEEG power density SPD ip adm in jsta tjon projongs NREM sleep ep isodes (A) but hasno effect on state transitions(B). (C) R iht shifting ofEEG power density curve prNREM sleep after SPD adm injstratjon(n=4*尺0. 05 VSvehicle) 用 如Fig3 C所示，SPD明显降低夜间 Wake期EEG的强度， NREM期 EEG的强度曲线右移，说明给药后小鼠的觉醒程度受抑制。 4讨论 脑电记录是睡眠研究的必要手段。本室建立的小鼠睡眠自动生物解析系统，与国内以往记录睡眠-觉醒的设备相比14，具有实时、安全、高效、稳定、自动给药、自动记录与分析等特点。它能长时间连续1Wk或更长时间)记录自由活动小鼠EEG/EMG并能自动分析睡眠觉醒时相，极大地降低了劳动强度，提高了准确性，使大规模从中药等植物中寻找生理性睡眠调节物质成为可能，同时也是睡眠基础研究不可缺的研究平台。 本实验中使用的 C57BL/6J小鼠是转基因或基因敲除最常用的背景品系。基因敲除动物可避免药理学工具药特异性不强或作用不完全引起的实验结果偏差。例如，以往药理学及电生理实验结果提示，对腺苷A和AA受体具有同等亲和力的咖啡因，其 促觉醒作用由腺苷A受体介导。但我们利用此系统，结合A和AA受体基因敲除小鼠，发现咖啡因能促进A受体敲除小鼠的觉醒，而不能改变AA受体敲除小鼠的觉醒水平，表明咖啡因的促觉醒效应是由AA受体，而非A受体所介导1561。高度自动化的睡眠解析系统对我国睡眠一觉醒机制的研究将产生积极的影响。 SPD是一种从千金藤属( stePhania) 植物地下块茎中提到的生物碱，对脑内多巴胺(Dopam ineDA)D和D具有很高的亲和性。在DA受体常敏态时，是 DA受体的拮抗剂。在超敏时，转化为 D激动一D阻滞的双重作用178]。这一特性使它在抗精神分裂症的治疗中有潜在的应用前景。在睡眠研究领域，越来越多的实验证据表明， DA参与觉醒的调控。激动 DA系统，增加动物觉醒；抑制 DA系统，则诱发睡眠[9~1。2我们利用本系统，首次观察了 SPD在 DA受体常敏状态下，对小鼠睡眠的影响。结果表明在小鼠觉醒期腹腔注射SPL)能延长NREM睡眠时间，降低觉醒量。 (致谢：SPD为中科院上海药物研究所金国章院士惠赠，谨致谢意!) 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Sleep Med Rey 200 7 11(2)： 1 13- ) Som nogenic effects ofL_stepholidine n m ice QIUMeihong， YUE Xiao ang， XU Xin hong，HUANG Zhih (1 SateKey Laboratory ofMedica lNeurobiopgy2 Dept ofPhama cojgyShanghaiMedical College of Fudan Universiy Shanghai200032 China) Abstract AmTo set up a hih y efective and autmatjc mouse sleep_wake bpassay systmand evauatethe system through anaysjs of the somnogenjc effects ofL stepholidine (SPD) argeting at dopan ieD/Drecepors in miceeiMethods The anjmals werehoused in an jnsu ated and soundproof recording chamberma jntajned at a constant tempera ture and hum idityon an autmaticaly con trolled 12 h lihy12 h daik cyce The electroencephalogram and electron yogramwere recorded contjnuously for 48 hours and anayzedby SleepSign sofwareSaline was adm inistered ip tothe mice at21： 00 on the firstdayand SPD was givenon the next day at the same hour The vigilance statewas ana lyzed based on the polygraphic recordings bythe same sofwareR esu lts The system has been demon strated to be hghly efficient and sable in recording and reliable in anayzing sleep_wake behavjorinm ice W ith he aid of the sleep bioassay systwefound hat SPD sgnificanty increased the toaltmespent in seep during dark perjodd and prolonged duratpns of non rapid eye movement sleep episodes with aconcm jtant reductjon in aount and EEG power density of wakefulnessSPD rendered no effect on rapideye move ent sleep ConcjusjonThrough the reliablemouse seep bpassay systm we found that SPDpromotes non rapid eye movement sleep but not rapideyemovm ent sleep in mjceKey words sleep EEGs EMG$Lstepholidinedopa m ine recep or antagon ist ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net SleepSign 动物睡眠分析系统是一个先进的软件系统，可用于许多科研领域。其自动睡眠分类统计功能和其它很多有用的功能大大减少了研究人员花费的时间和精力。 此外， SleepSign 使您可以生成所需的关于睡眠研究领域各种类型的报告。 这些报告使您很容易掌握睡眠质量与睡眠量。 全新版本 3.0 已实现新的算法，它比以前的睡眠评分方法更快。一、波形查看器可以选择 4 秒至 24 小时数据长度的页面。 如果事件已采集到，波形上会立即显示此事件。事件搜索功能可以直接跳到这个事件被采集到的位置。 右底部的窗口 (FFT) 显示当前选定时间的 FFT 频谱。一、阶段评分自动评分功能包括很多有用的功能，可以大大减少在睡眠/觉醒阶段的手动操作评分时间。1.自动评分SleepSign 睡眠/唤醒分析基于脑电图与肌电图。研究人员可以根据自己的实验情况调整自动评分的标准。自动评分结果可以手动修改。新功能多个动物可以仅用一个步骤预置执行。可以大大减少你花在评分上的时间和劳动。2．手动评分手动可以通过使用鼠标或小键盘很容易的为睡眠/觉醒阶段进行评分。每页可显示三或五行，并一次得分。可以在页面 （页面分割 FFT） 中显示每个时间段的 FFT 频谱。 为唤醒睡眠阶段评分时，可以参考这些 FFT 频谱。 可以列出符合条件的多个阶段的自动评分。 此功能可帮助您查看并修改自动评分结果的细微部分。时段长度可以选择 4、 5、 8、 10、 12、 20、 30、60 秒。 您可以选择 pre-assigned 阶段 （是否清醒，快速眼动，非快速眼动，光的影响，睡眠深度等） 和三个 un-assigned 阶段来达到你的要求。3. 项目研究阶段自动或手动指定其中一个时间段作为项目研究的时段。 从表示睡眠质量的平均FFT部分中排除指定时间段，然后得出表示睡眠量的阶段图和警觉状态参数。 如果此时段有特别迹象显示，那么这个时段名称上方会显示一个星号。三．Hypnogram/趋势图将 Hypnogram 作为显示评分结果的阶段。 此外， 各种信息可以在 Hypnogram 上相同的时间段内显示为趋势图。 趋势图的内容包括 ；Ø FFT 分析结果Ø 百分比或特别的某个时段 （如 delta ，Theta，主轴) 波形的频率。Ø 肌电图积分Ø （适用于绘制参数如温度，血压） 一个时期的最大值或最小值。Ø 其他参数* 您导入 DSI Dataquest A.R.T 系统的数据文件，可以显示参数文件中保存参数的趋势图 （如活动、 温度、 心率等标签参数)。您可以打印 Hypnogram 和趋势图，以及将其保存为文本文件或位图文件。四、阶段图SleepSign 计算总持续时间或任何时间段和时间范围内分期睡眠/觉醒的百分比，并绘制阶段图。 您可以打印阶段图，以及将其保存为文本文件或位图文件四、警惕状态参数SleepSign 可以显示随着持续时间分组（睡眠/觉醒阶段的一组）的列表。 此外，显示频率，平均持续时间和每一组的标准差。 可以计算和显示的任何时间段和时间范围的警觉状态参数 (ex: 有光与黑暗期，或每6 小时）。 具有此功能，您可以轻松地掌握睡眠/唤醒模式的过渡。您可以将警觉状态参数结果保存到文本文件中。您还可以获得按持续时间的每一组频率四、平均 FFTSleepSign 计算每个时间仓及时间范围内的每个睡眠/觉醒阶段平均 FFT 频谱。 可以将结果保存为文本文件。 平均的 FFT 频谱通过比较这些单位或不同时间段内的数据作为睡眠质量的指标 （例如： 有光与黑暗期，睡眠剥夺与控制）。中度光期和黑暗期的平均 FFT 的非快速眼动期和快速眼动期测量四、其他功能* 数字筛选您可以应用每个通道的低路径筛选器、 高路径筛选器、 带路径滤波器、 波动停止的筛选器或平滑，。* 保存为位图文件可将下列的图像保存为位图文件： 全窗口、 波形，Hypnogram/趋势图、 图阶段，等。* 打印您可以打印下面的图像： 波形 Hypnogram/趋势图，阶段图* 保存为文本文件可以将以下值存储为一个文本文件： Hypnogram/趋势图，导致警觉状态原始数据参数的 FFT、阶段图等您可以打印自动评分参数，也可以将其保存为文本文件