穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯检测方案(毛细管电泳仪)

分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷第12期2008年12月Vo1.27.No.122008-12 胶束毛细管电泳在线扫集技术同时分离测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的研究 李利军*1，吴峰敏23，喻来波，冯军，吴健玲，孔红星' (1.广西工学院生物与化学工程系，柳州545006；2.河南科技大学化工与制药学院，洛阳471003；3.广西大学化学与化学工程学院，南宁530005) 摘要：采用胶束毛细管电泳在线扫集技术分离测定了中药穿心莲中脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯。电泳条件：以20 mmol/L HBO：-10 mmol/L NaH PO4-50mmol/L SDS(含体积分数20%甲醇，pH2.4)为电泳运行缓冲溶液，未涂层石英毛细管(58cm×50pmi.d.，有效长度为41.2 cm)为分离通道，重力进样，进样高度为11 cm， -20 kV 恒压，检测波长为246 nm。富集倍数可以达到200倍以上。在5.70~91.20 mg/L，和3.96~31.68 mg/L 范围内呈良好的关性关系，对两种内酯分别进行了定量分析。加标平均回收率脱水穿心莲内酯为100.80%，穿心莲内酯为98.06%。 关键词：毛细管电泳；在线扫集；穿心莲；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2008)12-055-04 穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andrographis pan-iculaua Nees) 的地上分燥部分。它具有清热解毒，凉血消肿的功效，主要用于感冒发热，咽喉肿痛等症。2000年版药典将穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯作为穿心莲药材的质量控制指标成分，对这两种酯的测定方法通常采用薄层色谱法和高效液相色谱法2~51，此外还有用重量法、碱水解法、比色法、分光光度法、薄层层析法、胶束电动毛细管色谱法以及薄层光密度法》测定。胶束扫集毛细管电泳法测定其含量目前尚未见报道。 毛细管电泳法(CE)由于柱上检测光程短，其浓度灵敏度比 HPLC低1~2个数量级，使毛细管电泳技术在应用时受到一定限制。采用阴离子胶束扫集，低pH的背景电解质抑制电渗流，样品带不含胶束相，背景带含有胶束相。当施加负高压时，由于电渗流的速率被抑制，阴离子胶束进入样品区带，中性或弱碱性的物质在胶束相中分配、富集，并被胶束携带着向前运动；随着分离的 进行，样品区带不断地被缩短，从而使样品浓度得以提高110]。 本实验建立了同时分离测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的在线推扫-胶束毛细管电泳的新方法，极大地提高了检测灵敏度。该方法简便、快速、样品杂质干扰少，而且灵敏度高、准确性高，检出限低，并应用于中草药穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的测定。 实验部分 仪器与试剂 ACS2000 型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司)；负电源：电压0~30kV可调；未涂层熔融石英毛细管(60 cm×50pmi.d.)、有效长度47 cm、检测波长240 nm。UV-2102PC型紫外-可见分光光度计(UNICO)； DL-60D 超声波清洗器(上海之信仪器公司)； PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品(中国药 ( * 收 稿日期：2007-07-27；修订日期：2007-10-24 ) ( 基金项目：广西自然科学基金(桂科自0481019)和广西教育厅科学研究基金(桂教科[2000]392)项目资助 ) ( 作者简介：李介军(1966-)，男，教授 ； E-mail： lilijun0562 @sina. com ) 品生物制品检定所)。HBOs、NaH，PO4、NaOH、甲醇、H，PO4、十二烷基磺酸钠(SDS)等均为分析纯。水为二次重蒸馏水。穿心莲(广西柳州桂中大药房)。 标准贮备液：分别准确称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品，用甲醇溶解配制成对照品贮备液，密封置于2℃下保存。实验时稀释至所需浓度. 1.22实验方法 1.2.1毛细管的处理 实验前依次用1 mol/LNaOH溶液、水分别冲冲15 min， 进样前用缓冲液冲洗15 min，实验3h后更换缓冲液。实验结束后用水冲洗，并用水浸泡过夜。所用溶液用前均用0.45m的滤膜过滤，并经超声波脱气30 min。 1.2.2 样品预处理取穿心莲约10g干燥至恒量，中草药粉碎机粉碎成粉，过孔径380pm筛后准确称取穿心莲粉末0.5000g，加入20mL甲醇恒温35C超声震荡 90 min (80 kHz)，放冷至室温，过滤，滤液转移至 25.00 mL 容量瓶中，用甲醇定容后，过0.45pm滤纸后密封置于2°℃保存。 1.2.3电泳条件电压：-52kV；进样方式：重力进样；进样高度： 11cm；进样时间：200s；检测波长240nm；环境温度：25℃；电泳缓冲液：20mmol/L H，BO3-10 mmol/L NaH PO4， 50 mmol/L SDS(pH为2.4)，体积分数20%甲醇。在此条件下，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰形良好且无杂峰干扰。对照品和样品的电泳分离谱图见图1。 2结果与讨论 2.1检测波长的选择 以甲醇为参比液，对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液在200~400 nm 波长之间进行扫描，发现穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在240nm 处均有较强吸收，因此实验选取240 nm 作为检测波长。 2.22运行电压的选择 考察了运行电压为-15~-28kV 时对富集效果和分离效果的影响。实验结果表明，样品组分的迁移时间随着运行电压的增加而缩短，峰面积随运行电压的增加而降低，由于本实验是在抑制电渗流的条件下进行的，所以随着运行电压的升高，电渗流变化不大，但是胶束的迁移速度加快，胶束迅速穿过样品区带，导致样品被扫集的幅度 降低，从而引起峰面积降低。随着电压的增加样品的分析时间缩短，峰形尖锐，在-20 kV时柱效高，样品峰峰形较好且各组分均完全分离。在分离电压高于-25kV时，电流较高，由于焦耳热效应的影响，基线的稳定性下降、基线漂移、噪音增大，柱效下降。综合考虑选择最佳运行电压为-20kV。 图11样品(a)和对照品(b)的胶束毛细管电泳在线扫集电泳谱图 Fig. 1 Electropherograms of standard reagents and samples1-脱水穿心莲内酯；2-穿心莲内酯 2.3 SDS浓度的选择 SDS在两种内酯的分离和富集中起决定性作用。本实验中考察了缓冲溶液浓度为 20 mmol/L 的H，BO 和 10 mmol/L 的 NaH PO4 (pH2.4)情况下，不同的 SDS(20， 30， 40， 50，60 mmol/L)对分离和富集效果的影响。结果表明，随着 SDS 浓度的增加，样品的迁移时间逐渐缩短，当浓度超过30mmol/L 时 ， SDS 浓度对迁移时间的影响不大，但是随着 SDS 浓度的增加，样品的峰面积逐渐增加，当浓度达到50 mmol/L时，峰面积达到最大值，当浓度大于50 mmol/L时，导致电流过高，不利于分离测定。因此选择50 mmol/L SDS浓度。 2.4 有机溶剂的选择 有机溶剂对被分离物质的分离度有很大的影响，缓冲溶液中不加任何有机溶剂时，样品迁移时间提前，但是样品溶液中杂质峰对脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的峰形存在严重干扰，不能达 到基线分离。过多的有机溶剂又会抑制缓冲溶液中胶束相的形成，同时使得被测物质迁移时间推迟，分析周期延长。主要考察了甲醇、乙腈、异丙醇对两种物质分离度和富集效果的影响，缓冲溶液中加入相同体积分数的乙腈和异丙醇郭，样品峰形差且不能达到较好的分离效果；加入甲醇时，分析周期缩短，分离效果和富集效果都比较好。本实验还考察了体积分数为10%~30%的甲醇对分离度的影响。实验结果表明，当甲醇体积分数为15%时，穿心莲内酯与其后一峰不能完全分开；当甲醇体积分数为20%时，脱水穿心莲内酒和穿心莲内酯分离效果很好，同时样品中被测物质能达到基线分离，无杂峰干扰。综合考虑选定甲醇的体积分数为20%。 2.5背景缓冲溶液 pH的影响 对pH2.0、2.2、2.4、2.6、2.8范围内进行了考察及优化。实验发现，随着pH的增大，脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的迁移时间随之延长，当pH在2.0~3.0之间时，脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯均能达到基线分离，具有较好的分离度，但在pH超过2.8时，脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的峰面积逐渐下降，使得富集倍数下降，同时迁移时间延长，导致分析周期较长，不利于快速分离。pH为2.0时，由于调节pH的 HPO加入较多，离子强度过大，使电流增大，超过仪器设定上限，综合考虑选择缓冲液pH为2.4。 2.6样品基体组成对富集效果的影响 考察了均一电场、样品区带电场减弱及样品区带增强3种模式下样品基体中 HBO： 浓度对富集的影响。主要考察了有机溶剂、pH、NaH， PO4浓度、H，BO浓度对富集效果的影响。实验表明，当溶液中加入NaH PO4时，富集倍数降低，因此选择在样品溶剂中不加入NaH PO4；考察了0~20%体积分数的甲醇对富集倍数的影响，实验结果表明，随着甲醇溶剂的增加，峰面积先增大后减小，当体积分数为10%时，峰面积达到最大，因此选择样品溶剂中甲醇的体积分数为10%；实验还考察了 15~60 mmol/L H，BO， 浓度对富集效果的影响，实验结果表明，随着 HBO；浓度的增加，相同浓度的样品峰面积先增加后减小，当浓度为40mmol/L 时，峰面积最大，所以选择样品溶剂中 H BO； 的浓度为 40 mmol/L。 2.7进样时间对富集倍数及分离的影响 在线扫集技术中，进样时间直接影响样品的扫集，从而影响方法的灵敏度。考察了进样时间在30，60，90，120，150，180，210，240s范围内对脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯峰面积影响。结果表明，随着进样时间的增加脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的峰面积随之增加，即富集倍数随进样时间的增加而增加。进样时间和峰面积在30~180s范围内呈良好线性关系，线性回归方程脱水穿心莲内酯：：Y=8.9732p-86.404(R=0.9974)；穿心莲内酯：：Y=24.8560-275.46(R=0.9990)。但是进样时间超过180 s，不在线性范围之内。当进样时间为180 s时，脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的富集倍数可达到200倍以上，进样时间超过200s后，分离度下降，谱峰展宽明显，基线噪音增大，不利于测定。因此选定样品的进样时间为180s. 2.8 线性关系的考察 以不同质量浓度的两内酯混合标准溶液(n=6)于选定条件下进行电泳分析。以峰面积y(n=3)对质量浓度(mg/L)进行回归分析，得线性回归方程分别为：穿心莲内酯Y=56.4890+62.218(r=0.996)，线性范围3.96~31.68 mg/L；脱水穿心莲内酯Y=45.483p-180.53(r=0.997)，线性范围5.70~91.2 mg/L。基于3倍信噪比(S/N=3)，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的检出限分别为0.396和0.721 mg/L。 2.9样品测定及加标回收实验 取样品提取液进行测定，用回归方程计算得到穿心莲药材中两内酯的含量。向已知含量样品中准确加人一定量的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯标准溶液，按"样品的制备"项下方法处理，进行加标回收实验，依法测定并计算回收率，结果见表1。 2.10重现性及稳定性实验 取同一规格、品种穿心莲中草药样品6份，按样品预处理1.2.2制备供试品溶液，测得脱水穿心莲内酯质量分数平均值为 0.5742%， RSD 为3.9%；穿心莲内酯质量分数的平均值为0.3464%， RSD 为1.4%。取对照品溶液，每隔1h进样，连续5h，结果5h内脱水穿心莲内酯和穿 心莲内酯的峰面积积分值基本稳定，峰面积的RSD分别为4.1%、1.6%。 表：1样品测定与加标回收实验(n=6) Tab. 1 Determination results of samples and recovery experiments (n=6) 分析组分 w/% 回收率/% RSD/% 脱水穿心莲内酯 0.57 100.8 13.9 穿心莲内酯 0.35 98.06 1.8 ( 参考文献 ) ( 11 ] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社.2000.220 ) ( 2商 陈敏武，徐德然，王峥涛等.中国药科大学学报， 1999，30(4) ： 291 ) ( [3]] 曾嵘，阎 每 敏，刘建存.湖南中医学院学报，2006， 26(4)：25 ) ( 朱卫泉，苏 静.药物分析杂志，2006，26(6) ： 855 ) ( 4 莫善列，思秀玲，韦 松.中成药，2005，27(12)： 1481 ) ( ] 颜玉贞，谢培山.中药新药与临床药理，1998，9(4)： 204 ) ( [7] 琦，胡广林，徐晓琴等.分析化学，2003，(4)： 4 ) ( [8] 3] 陈德昌，邵爱新，蔡英娜等.药物分析杂志，1986，6(4)：232 ) ( 9 Albin M， Gossman P D， Moring S E. 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In this work， a sweeping micellar electrok-inetic capillary chromatographic method has been developed for separation and quantitative analysis of these two compounds in andrographis paniculata nees. Electrophoretic conditions are as follows： uncoated fused silica capillary(41.2 cm/58 cm， 50p mi.d.)，20 mmol/L boric acid-10 mmol/L sodium dodecylsulfate-50 mml/L SDS containing20 % methanol (V/V) at pH 2. 4， applied voltage -20 kV， detection wave-length 240 nm， injection by gravity withthe height 11 cm. Up to 200-fold improvement in enrichment was achieved by using this sweeping injection technique.Both of the analytes were separated successfully within 10 min under the optimum conditions. The relative peak areasof the two analytes increase linearly with the increase of their concentrations in the range of 5.70~91.2 mg/L for de-hydroandrographolide and 3.96~31.68 mg/L for andrographolide， and the average recoveries are 100.8 % and98.06%， respectively. Key words： Capillary electrophoresis； Sweeping； Andrographis paniculata nees； Andrographolide； Dehydroan-drographolide —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net