唑来膦酸制剂中唑来膦酸检测方案(毛细管电泳仪)

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2008.28(6)--870ww 毛细管区带电泳测定唑来膦酸及其制剂的含量* 赵静，郭慧娟，蒋晔1* 1.河北医科大学药学院，在家庄050017：2.石药集团中诺药业有家庄)有限公司产品开发部、在家庄050051 摘要 目的：建立简便、快速分析唑来膦酸及与具有美物质的毛细管区带电泳方法 方法：采用非涂渍石英毛细管(50cmx50 p.m)为分离通道.3 mmol·1.磷酸盐缓冲液(pH7.9)为运行缓冲体系；工作电压25kV；进样电压2kV，进样时间5s；紫外检测波长210mm结果：唑米膦酸在31.2~998 pgml，的范围内线性关系良好(r-(.9997)；注射用唑来膦酸的平均间收率(=9)为100.2%，RSD为1.1%；唑来膦酸注射剂的平均回收率(n=9)为100.7%，RSD 为1.0%；最低检测限为 10. 4ug·nl.，该条件下唑来膦酸与其有关物质分离良好 结论：本方法简便、快速、灵敏、为唑来膦酸生产合成中的质量控制提供了种新的可靠的分析手段 关键词：毛细管区带电泳；唑来膦酸；含量测定；有关物质 中图分类号：R917 文献标识码：\ 文章编号：0254-1793(2008)04-08700 Determination of zoledronic acid and its preparationsby capillary zone electrophoresis ZHAO Jing ，GCO Hui-juan，JIANG Yels 1. lustitule of Pharmacy， HebeiWediral I niversily，Shijiazhuang 050017.China； 2. Shijiazhuang Pharma. Group Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) CO..LTD，Shijiuzhuang050051， China Abstract Objective：To estebalish a simple and rapid capillary zone clectrophoresis method for the analysis ofzoledron aend and its related sulslance. Methods： An uncoated fused -silica capillary column of 50 cm x50 umwas used. The method was developed by utilizing a electrokinetic injection(2 k\，5 s)，a running voltage of 25 kVand a 3 mmol1phosphate electrolyte solution at pH 7.9. The detection wayclength was 210 nm. Results： Thecalibration curve was linear in the range of 31.2 -998 pgml. (r=0).9997)， the average recovery of zoledronieacid for injeclion was 100.2%with RSD of 1. 1%e ；for zoledronic acid injection the average recovery was 100. 7%with RSD of 1. 0% ；the L0D was 10.4 pgml.. the active ingredient - zoledronic acid was successfully separa-ted from its related substance. Conclusion： The method is simple，rapid and accurate； it provides a new reliablemneans for the quality control of zoledronic acid. Kcy words：capillary zone electrophoresis； zoledronie acid：content determination； related substanee 唑米膦酸为第代代膦酸.临床主要用J治疗骨质疏松症，高钙血症以及肿瘤引起的骨相关疾病，近年米发现具可诱导肿瘤细胞的凋亡，有望直接用来治疗癌症 前、该药物的测定方法主要有HPLC法、、离子交换色谱法.7.、酶分析法等，采用毛细管电泳法测定唑来膦酸含量的方法尚未见报道唑来膦酸含多个N原子，可与色谱柱上l的硅作用丛而色谱峰拖，其二膦酸部分可能会与色谱柱上的痕量金属离子发生反应导致峰 形异常该类药物的板性强，在反相色谱柱上不保留，这给 HPLC法的直接使用带来较大的困难，本文通过优化电泳条件，建立了简便、快速的唑来膦酸分析方法 1 仪器与试药 毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)；未涂层英毛细管(河北永年光导纤维厂)[50 cm(有长为43 (m) x.50 u!ml)；紫外检测(北京彩陆科学仪器有限公司)，CT22色谱信号采集器 (南京千谱软件公司)。 唑来膦酸对照品(纯度为99.7%，河北医科大学药学院)；唑来膦酸原料药3批(批号为040914，040915，040916)、注射用唑来膦酸(粉针剂)3批(规格每瓶4mg，批号为050416，050417，050818)、唑来膦酸注射剂3批(规格为1mL：1 mg，批号为050306，050407，050708)均由河北医科大学生物医学科技中心提供；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯；水为重蒸水。 2 电泳条件 运行溶液：3 mmol·I磷酸盐缓冲液(pH7.9)；工作电压25 kV，电流9~10 uA；进样电压2kV，进样时间5s；温度25℃；紫外检测波长210 nm。 开机后用0.1 mol·L的氢氧化钠溶液冲洗10 min，水冲洗10 min，运行缓冲液冲洗 10 min，每次进样前用0.1 mol·L氢氧化钠溶液、水和运行缓冲液分别冲洗3 min。所有溶液在使用前均用0.45 p.m 的纤维树脂膜滤过。 溶液的制备 3.1 对照品储备液 精密称取唑来膦酸对照品约25 mg 置5 mL量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为储备液(浓度为4.99 mg·mL)。 3.2 供试品溶液 取唑来膦酸原料药、注射用唑来膦酸、唑来膦酸注射剂适量，分别置10 mL量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 4 方法与结果 4.1 方法的专属性 在本文电泳条件下，唑来膦酸对照品、唑来膦酸与咪唑乙酸混合液色谱图分别见图1-A、B。由图1可见，唑来膦酸的合成原料药咪唑乙酸不干扰唑来膦酸的测定，理论塔板数以唑来膦酸计不低于10000，唑来膦酸峰形良好，基线较平。 4.2 线性关系考察 精密吸取对照品储备液2mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为1号对照品溶液，再从1号工作液中吸取5 mL 置10ml量瓶中，得2号对照品溶液，依此法对倍稀释得3，4，5，6号系列对照品溶液，浓度分别为998，499，249，125，62.4，31.2 ug·mL。按"2”条件进样5s，记录色谱峰面积，以峰面积A对浓度C(ug.mL)进行线性回归，得线性方程： 结果表明：唑来膦酸在31.2~998ug·mL-的浓度范围内线性关系良好， 4.3 最低检测限 取唑来膦酸线性标准溶液稀释，进样并记录电泳图，按 S/N=3计，唑来膦酸最低检测限为10.4 ug·mL-，咪唑乙酸最低检测限为 6 图1 来膦酸 CE 色谱图 Fig 1 The CE chromatographs of zoledronic acid A.唑来膦酸对照(reference substance) B. 唑来膦酸与咪唑乙酸混合液(mixture of zoledropic acid and imidazoleacetic acid)1.唑米膦酸( zoledronic acid) 2.咪唑乙酸( imidazoleacetic acid) 1.12 ugmL 4.4 精密度试验取同一唑来膦酸供试品溶液，连续进样分析5次，记录峰面积，唑来膦酸的色谱峰面积的 RSD 为0.5%。 4.5 稳定性试验 取同一唑来膦酸供试品溶液在相同电电条件下分别于0，1，2，4，6，8h 进样5s，记录色谱峰面积，所得峰面积的 RSD 为0.6%，结果表明唑来膦酸溶液在8 h内稳定。 4.6 回收率试验 按注射用唑来膦酸和唑来膦酸注射剂处方，分别取唑来膦酸对照品与辅料适量，精密称定，配成标示量80%，100%，120%3种浓度的溶液，进样5s，计算回收率及 RSD。结果见表1。注射用唑来膦酸的平均回收率(n=9)为100.2%，RSD为1.1%；唑来膦酸注射剂的平均回收率(n=9)为100.7% ，RSD 为1.0%。 表1 唑来膦酸回收率试验结果(n=3) Tab 1 Results of recovery of zoledronic acid 样品 加人量 测得量 平均回收率 RSD (added) (detecled) (average (sample) /% /ug·mL- /pgml， recovery)/% 注射用唑米膦酸 200.0 200.3 100.2 (zoledronie acid 248.7 250.2 100.6 Ior injection) 300.3 299.9 99.9 0.7 唑来膦酸注射剂 198.2 197.5 99.7 (zoledronie acid 247.4 250.1 101. iection) 290.0 19.5 101.2 4.7 样品含量测定 取唑来膦酸原料药、注射用唑来膦酸和唑来膦酸注射剂的供试品溶液，分别进样5s，以标准曲线法测定样品的含量。原料药以干燥 品计，注射用唑来膦酸和唑米膦酸注射剂以标示量计，结果见表2 表2 样品含量测定结果(n=3) Tab2 Results of zoledronic acid contents 样品 批号 含量 RSD (sample) (Lo10. (conlent).% .￥ 原料药(budlk materal) 040914 99.3 1.3 040915 98.7 040916 99.1 注射用唑米膦酸 050416 99.3 (zoledronie acid for injection ) 050417 101.1 050818 100.4 1.5 唑来膦酸注射剂 050306 99.7 1.1 (zoledrunie acid injection) 050407 100.2 09 050708 99.2 1.1 5讨论 5.1 电泳条件的优选 本试验考察了不同缓冲体系(包括其浓度和pH)、工作电压对峰形及保留的影响，同时优化了色谱条件.. 缓冲体系的选择：本试验考察了硼酸-硼砂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Tris-盐酸、柠檬酸柠檬酸钠缓冲体系。 Tris - 盐酸缓冲溶液中的离子一般较大，在较高的浓度下电流仍然很小，但其有较强的紫外吸收，本试验检测波长为210 mm，属于未端吸收，所以应用该体系干扰较多并且在此体系中唑来膦酸峰形差；另改用硼酸-硼砂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，但在改变浓度、pH、工作电压等条件下均不能改善峰形，在此基础上加入表面活性剂 SDS、CTAB 等也无效且保留时间在40 min 左右甚至史史晚；而磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液在改变浓度峰形有所改变，故最终选定其为缓冲体系 缓冲溶液浓度：离子强度(浓度)主要影响双电层厚度，离子强度越大双电层越薄，电渗降低；同时浓度越大电流越大，其产生的焦耳热也越大，基线噪声提高.故在工作电压为25 kV、缓冲液pH为7.9的条件下，本试验考察了缓冲液在不同浓度(200，168.50.25.5 mmol.1.时对桌膦酸峰形及保留情况的影响，结果发现浓度为 3 mmol·L时峰形尖锐，故选定缓冲液的浓度为3mmol·L 缓冲溶液 pH：随着 pH增加，石英毛细管表面硅醇基解离增加，电渗因此增强，保留时间继而缩短；另外唑来膦酸在水中主要以阴离子形式存在，pH增加则其解离能力增强，故本试验考察了工作电压为25 kV、缓冲液浓度为3 mmol·L-时，缓冲液在不同 pH(6.0，6.5，7.0，7.5，7.9)下对迁移的影响最终选定缓冲溶液的 pH 为 7.9. 工作电压：本试验考察了在3 mmol·LpH 7.9的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系下，不同工作电压(10，15，17，20，25 kV)对迁移的影响结果发现背景电流在上述条件下均较小，但因工作电压越大，保留时间越短，故最终选定工作电压为25 kV 在选定的电泳条件下，以硫脲为电渗流标记物，出峰时间约为 1.3 min， 唑粦膦酸出峰时间为4.2min，咪唑乙酸出峰时间约为 2.4 min 5.2 小结咪唑乙酸是合成唑来膦酸的主要原料药，其可能会残留在唑来膦酸成品中。因该物质与唑来膦酸的极性差别较大，采用液相色谱法需同时解决咪唑乙酸和唑来膦酒的保留问题，这给液相色谱法带来了较大的困难.利用两者在碱性环境中均主要以离子形式存在的特点，本文建立了毛细管区带电泳法，该方法简便、快速，同时为该药物生产过程中的质量控制提供了一种可靠的分析手段 ( 参考文献 ) ( Manuela B ezzi， Meriem H asmim. 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