银黄胶囊中黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素及绿原酸检测方案(毛细管电泳仪)

。294·中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2008，39(4) 银黄胶囊中黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素及绿原酸的毛细管电泳法测定 龚红全，毋福海*，张晖燕^ (广东药学院，广东广州510224) 摘要：建立了CE法同时测定银黄胶囊中黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和绿原酸。采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱，以40mmol/L 硼砂溶液-15mmol/Lβ-环糊精(pH9.35)为运行缓冲液，分离电压12kV，重力进样，检测波长280nm。以对氨基苯甲酸为内标，黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、绿原酸的线性范围分别为2.5~12.5、10~80、1.25~10、15~120ug/ml；平均回收率分别为104.6%、97.2%、98.5%、95.8%， RSD分别为1.71%、2.91%、2.09%、2.83%。 关键词：银黄胶囊；黄芩素；汉黄芩苷；汉黄芩素；绿原酸；毛细管电泳；测定 中图分类号：TQ460.7*2；O657.8 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2008)04-0294-03 Determination of Baicalein， Wogonoside， Wogonin and Chlorogenic Acid in YinhuangCapsules by Capilary Electrophoresis GONG Hong-quan， WU Fu-hai*，ZHANG Hui-yan- (Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510224) ABSTRACT： A CE method was established for the determination of baicalein， wogonoside，wogonin andchlorogenic acid in Yinhuang capsules. An uncoated fused silica capillary was used with 40mmol/L borax solution-15mmol/L B-CD buffer solution (pH 9.35)as running buffer at applied voltage of 12kV and detection wavelengthof 280nm. The sample was injected by gravitational force. p-Aminobenzoic acid was used as the internal standard.The linear ranges of baicalein， wogonoside， wogonin and chlorogenic acid were 2.5-12.5， 10-80，1.25-10.0 and 15-120ug/ml， respectively. The average recoveries were 104.6%， 97.2%，98.5% and 95.8%， with RSDs of 1.71%，2.91%，2.09%， 2.83%， respectively. Key Words： Yinhuang capsule； baicalein； wogonoside； wogonin； chlorogenic acid； CE； determination 银黄胶囊是由金银花提取物与黄芩提取物制成的中药成方制剂，具清热解毒之功效，临床用于治疗急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎和上呼吸道感染。有文献报道黄芩苷的HPLC法测定[国家食品药品监督管理局标准(试行)YBZ13372004]，黄芩药材中黄芩素(baicalein， 1)、黄芩苷等组分的HPLC ( ▲本院公共卫生学院卫生检验专业2003级学 生 ) ( 收稿日期：20 0 7-10-09 ) ( 基金项目：广东省自然科学基金资 助 项目(50 0 2841) ) ( 作者简介： 龚 红全(1981 ) ，男，硕士 研 究 生， 专业方向：现代分析方法 在 中药质量控 制 中的应用研究。 ) ( Tel： 0 13631430501 ) ( E-mail： gonghongquan@163.com ) ( 通讯联系人：毋福海(1961)， 男 ，教授，从事现代分析方法在中药质 量 控制中的应用研究。 ) ( Tel：013610124722 ) ( E-mail： fuhaiwu@163.com ) 测定和银黄胶囊中黄芩苷、绿原酸(chlorogenicacid， 4)的HPLC测定。但未见毛细管电泳(CE)法同时测定1、汉黄芩苷(wogonoside， 2)、汉黄芩素(wogonin， 3)和4含量的报道。本研究建立了CE法，以对氨基苯甲酸为内标，测定银黄胶囊中1、2、3、4组分，方法分离效果好、快速、简便。 1仪器与试药 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)； K-2501型紫外-可见检测器(德国诺尔公司)；HW-2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。 1、3、4对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为111595-200604、111514-200403、110753-200411，含量均为99.9%)；2对照品(安徽芜湖尔尔塔医药科技有限公司，含量98.04%)；银黄胶囊(中山市中智制药有限公司，批号分别为20050905、20050906、20050910，每粒0.3g)；其它试剂均为 分析纯，水为重蒸水。 2方法与结果 2.1 溶液的配制 内标贮备液：精密称取对氨基苯甲酸适量，加甲醇溶解并稀释制成100ug/ml的内标贮备液。 对照品溶液：精密称取1、3对照品各12.5mg，各置250ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，分别作为1、3对照品贮备液；精密称取2对照品10mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为2对照品贮备液；精密称取4对照品15mg， 置25ml量瓦中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，作为4对照品贮备液。 供试品溶液：取本品20粒，精密称定，倾出内容物，精密称取混匀的内容物细粉约0.5g， 置具塞锥形瓶中，加50%甲醇50ml，称定，超声处理60min，冷却后称重，用50%甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤。精密量取续滤液2ml，置10ml 量瓶中，精密加入内标贮备液1ml，加50%甲醇定容，摇匀，经0.45um滤膜过滤，作为供试品溶液。 运行缓冲液：精密称取硼砂3.05g、β-环糊精(B-CD)3.40g置200ml量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，经0.45um滤膜过滤，作为运行缓冲液。 2.2 电泳操作条件 毛细管柱未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75pm×55cm)；运行缓冲液 40mmol/L硼砂溶液-15mmol/L B-CD(pH9.35)；分离电压 12kV；重力进样 5s(高度15cm)；检测波长280nm；温度25℃。 为使在高电压下正常运转，环境相对湿度需小于70%。毛细管柱使用前依次用0.1mmol/L氢氧化钠溶液、水、运行缓冲液各冲洗约5min。样品分析间隔用运行缓冲液平衡2min。在此条件下，对照品溶液、供试品溶液色谱图见图1。 图1对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的毛细管电泳色谱图 2.3 线性试验 取适量1、2、3、4对照品贮备液与内标贮备液，分别加甲醇稀释成含12.5、5、7.5、10、12.5ug/ml，含210、20、40、60、80ug/ml，含31.25、2.5、5、7.5、10ug/ml，含415、30、60、90、120ug/ml，内标浓度均为10ug/ml的溶液，进样测定。以对照品与内标峰面积比值(Y)对相应对照品溶液浓度(c)进行线性回归，得1、2、3和4的回归方程分别为： Y=0.0406c +0.0033， r=0.9986； Y=0.0563c，+0.1346， r=0.9981； Y=0.1199cg+0.0240，r=0.9995； Y=0.0160c+0.0517， r=0.9984。表明1、2、3、4分别在2.5~12.5、10~80、1.25~10和15~ 120ug/ml度范围内与峰面积的线性关系良好。 2.4 精密度、稳定性和重复性试验 取1、2、3、4浓度分别为7.5、40、5、60ug/ml的对照品溶液，重复测定5次，计算得各对照品峰面积RSD分别为1.08%、1.35%、0.72%、0.77%。 取供试品溶液于0、2、4、6、8、10、12h，分别进样测定，1、2、3、4峰面积的RSD分别为1.15%、0.74%、2.68%、0.93%，表明供试品溶液在12h内稳定。 取同一批(批号20050906)样品6份，按“2.1”项下方法提取、测定。结果测得1、2、3、4的平均含量分别为4.72、13.74、1.31、12.00mg/g，RSD分别为2.57%、1.97%、2.87%、2.88%。 2.5 回收率试验 精密称取银黄胶囊(批号20050906)共6份，加入适量1、2、3、4对照品，按“2.1”项下方法处理并测定，计算得1、2、3、4的平均回收率分别为104.6%、97.2%、98.5%、95.8%， RSD分别为1.71%、2.91%、2.09%、2.83%。 2.6样品测定 取银黄胶囊3批，按“2.1”项下方法处理后测定，记录峰面积，由回归方程计算样品中1、2、3、4的含量，结果见表1。可见，不同批号样品含量差异较大，可能与生产时所投药材质量有关。 表1样品测定结果 批号 1 2 3 4 含量/mg·粒 RSD/% 含量/mg粒 RSD/% 含量/mg粒 RSD/% 含量/mg·粒 RSD/% 20050905 1.33 3.00 4.17 2.88 0.40 2.27 3.93 2.11 20050906 1.44 2.58 4.18 1.96 0.40 2.67 3.65 2.88 20050910 7.32 0.94 1.53 1.37 2.51 0.74 2.39 0.79 3讨论 3.1检测波长的选择 1、2、3、4分别在275、270、278和315nm处有最大吸收，因样品中1、3的量远低于2和4，故参照文献的波长选择原则，以280nm作为检测波长。 3.2 内标物的选择 为克服毛细管电泳重现性差的缺点，本研究采用内标法定量。曾选用在280nm处有吸收的苯甲酸钠、对硝基苯甲酸、对氨基苯甲酸为内标物，结果苯甲酸钠在体系中不出峰；对硝基苯甲酸与4峰后一未知峰分不开；对氨基苯甲酸峰型好，在样品中无干扰，故选作内林物。 3.3 电泳条件的选择 黄芩药材及银黄制剂3-51中黄芩苷、4的含量测定，主要采用毛细管区带电泳，缓冲液为硼砂溶液。因1、3极性较强，易离子化，在硼砂溶液中，1中邻二羟基基团更易形成络离子⑥，加大离子化；但只用硼砂时1和3峰完全重叠。尝试添加十二烷基磺酸钠、羟丙基-β-CD，效果均不好，故本研究选择硼砂溶液-β-CD为运行缓冲液。同时在β-CD浓度为5~20mmol/L，硼砂 ( S39-25 苯偶姻的制备 Iwamoto K等[Tetr a hedron Lett， 2006， 47：7175 ) 芳香醛碱性条件下于水中经溴化1，3-二正十二烷基苯并咪唑鑰作用，室温反应1~30h生成苯偶姻。8例收率为38%~ 溶液浓度为10~50mmol/L，缓冲液pH7.0~10.0，工作电压为9~24kV范围内分别进行试验研究，最终选择40mmol/L硼砂溶液-15mmol/L β-CD溶液(pH 9.35)为运行缓冲液，工作电压为12kV。 ( 参考文献： ) ( [1 ] 周晓宁，杨 滨.高效液相色谱-电化学检测法测定黄芩中3种有效成分的含量[J] . 中国 中 药杂志，2006，31(1)：47-50. ) ( 2 刘永利，李冬梅，冯 吗 丽， 等 .RP-HPLC同时测定银黄胶囊中绿原酸与黄芩苷含量[J]. 中成 药，2006，28(8)：1142-1144. ) ( [3] Yu K ， Gong Y-F， Lin Z-Y，e t al.Quantitative analysis and chromatographic f i ngerprinting for the quality evaluation of Scutellaria b aicalensis G eorgi u s ing c a pillaryelectrophoresis [ J]. 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