栀子苷、芍药苷及丹皮酚中有效成分检测方案(毛细管电泳仪)

第26卷第5期2007年5月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.26.No.52007-5 高效毛细管电泳同时分离测定栀子苷、芍药苷及丹皮酚的研究 李利军：*1 冯 军，黄文艺，钟招亨，吴健玲?，孔红星 (1.广西工学院生物与化学工程系，柳州545006；2.广西大学化学与化学工程学院，南宁530004) 摘 要：建立了同时分离测定栀子普、芍药和丹皮酚的高效毛细管电泳新方法。以十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂形成胶束、甲醇作为有机改性剂、NaOH溶液为背景电解质，在234 nm波长下紫外检测。对十六烷基三甲基溴化铵、NaOH的浓度以及有机改性剂、分离电压等因素对分离的影响做了系统的研究，确立了栀子苷、芍药苷和丹皮酚的最佳分离条件。栀子子、芍药药、丹皮酚分别在20~100 ug/mL，5~80 ug/mL ，2~20 ug/mL范围内呈较好的线性关系，回收率分别为99.00%~100.27%，99.49%~101.83%，97.11%~99.06%。方法已用于加味逍遥丸中3种成分的检测。 关键词：高效毛细管电泳；栀子苷；芍药苷；丹皮酚；加味逋透丸 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2007)05-038-04 加味逍遥丸也叫丹栀逍遥丸，是由逍遥丸冷剂中的甘草、当归、茯苓、芍药、白术、柴胡、干姜、薄荷等中药加入牡丹皮、栀子二味中药组成的。牡丹皮和栀子都是清热凉血的要药，具有良好的清热、止血、活血、消瘀等功能。因此，加味逍遥丸除具有逍遥散的舒肝益血、健脾和中的功效，还具有清肝热和营血等功能，常用于治疗肝脾血虚、阴虚发热、盗汗、怔忡不宁、月经不调、小腹作痛、小便涩痛及内热烦渴等症。栀子苷和丹皮酚分别是栀子和牡丹皮的重要有效成分，故以芍药苷为质量控制指标外，还应以栀子苷、丹皮酚为指标。因此，同时分离测定这三种成分在本品的质量控制上尤为重要。目前分离测定栀子苷、芍药苷和丹皮酚的方法主要有薄层扫描法、薄层色谱法2、高效液相色谱法13~5]等。 毛细管电泳(HPCE)以其柱效高，分离速度快，试剂和样品消耗少、成本低，耐污染，在中草药及其制剂的分析中有着高效液相色谱无法企及的优点，单独分离测定丹皮酚的高效毛细管电泳 法已有测定16]，，同时分离测定芍药普和丹皮酚的高效毛细管电泳法也已经有报道>，但尚未见同时分离测定栀子苷、芍药苷和丹皮酚3种组分的报道。栀子苷和芍药苷为中性物质，在溶液中不带电荷，采用毛细管区带电泳无法进行分离测定，本文采用十六烷基三甲基溴化铵形成胶束、甲醇为有机改性剂、以NaOH溶液为背景电解质，探索用胶束毛细管电泳法同时分离测定栀子苷、芍药苷和丹皮酚的可能性，建立了高效毛细管电泳同时分离测定三者的新方法，用于加味逍遥丸的测定，结果满意。与高效液相色谱法相比，该法具有分析周期短、准确、精密度高、样品杂质干扰少等优点。 实验部分 1.1 仪器和试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，电源：电压0~30 kV 可调、未涂层熔融石英毛细管中75 um，总长45 cm、有效长度30cm、检测波长234 nm。UV-2102PC型紫外-可 ( * 收稿日期：2006-06-08；修订日期：2006-08-18 ) ( 基金项目：广西自然科学基金(桂科自0146001)和广西教育厅科学研究基金(桂教科[2000]392)项目资助 ) ( 作者简介：李利军(1966-)，男，教授 ) 见分光光度计(UNICO instruments CO. ，LTD)；DL-60D 超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；RE 52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。 栀子苷、芍药普、丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所)。 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、NaOH、甲醇等试剂除特别注明外均为分析纯。水为二次蒸馏水。加味逍遥丸(市售)。 1.2 电泳条件 电压：15 kV；进样方式：重力进样；进样高度：11cm；进样时间：30s；检测波长234nm；环境温度：25℃； CTAB 浓度为 8 mmol/L、NaOH浓度为4 mmol/L，体积分数2.5%的甲醇。 1.3 实验方法 毛细管的处理：实验前依次用1 mol/L NaOH水溶液、水分别冲少15 min ， 进样前用缓冲液中洗30 min，实验4h后更换缓冲液。实验结束后用水冲洗，并用水浸泡过夜。实验所用的溶液进样前均用 0.45 um 的滤膜过滤，并经超声波脱气30min。 样品预处理：取加味道遥丸6g研磨成粉，准确称取加味逍遥丸粉末1.000g，加入10mL甲醇，超声波振荡提取30 min。放冷至室温，过滤后将滤液旋转真空挥干，用水超声振荡溶解，0.45 um滤纸过滤后定容至50 mL。所得溶液用水稀释3倍后进行测定。 标准贮备液：精密称取栀子苷对照品0.0010g、芍药苷对照品0.0036g、丹皮酚对照品0.0052g，用水溶解，分别定容至10mL，配制成浓度为100、360、520 ug/mL 的对照品贮备液；上述溶液均用0.45 um 滤纸过滤，超声除气，置冰箱4 ℃保存。 2 结果与讨论 2.1 检测波长的选择 以水为参比液，分别对栀子苷、芍药苷和丹皮酚溶液在200~400 nm 波长之间进行扫描，发现栀子苷、芍药苷和丹皮酚在234nm处附近均有较强吸收，因此选用234nm作为检测波长。 2.2 电泳分离介质的选择 2.2.1 电泳缓冲液的选择 选择了硼砂、乙酸-乙酸钠等不同的缓冲体系，结果表明，在这些缓冲体系中栀子苷、丹皮酚均不出峰。选择阳离子 表面活性剂 CTAB，直接用NaOH调节pH，并加入有机溶剂甲醇改善分离度进行试验，结果表明，栀子普、芍药苷、丹皮酚峰形良好且无杂峰干扰。因此确定 CTAB-NaOH甲醇为电泳分离介质。 2.2.2 表面活性剂浓度的影响 表面活性剂的浓度对芍药苷、丹皮酚的迁移时间有较大影响，随着 CTAB 浓度的增大，丹皮酚的迁移时间明显延长，芍药苷迁移时间受 CTAB 浓度的影响较小，但也随 CTAB 浓度的增大而延长，栀子苷迁移时间基本无改变。实验考察了不同浓度 CTAB 时对3种物质迁移时间的影响，结果见图1.从图1知，3种物质的迁移时间均随 CTAB浓度的增大而增大，这可能与分离物质的疏水性有关，栀子苷与芍药苷的糖基上具有多个邻位羟基，亲水性很强，它们疏水性的差别主要体现在配基上，而丹皮酚的结构中含有苯环，疏水性较栀子苷和芍药药要强得多，因此丹皮酚受 CTAB浓度的影响最大。在试验中还发现，随着 CTAB 浓度的增大，相邻峰的分离度增大。但是同时引起基线噪音增加，灵敏度下降、迁移时间延长等负面效应，从而使信噪比和柱效降低、分析周期延长。CTAB 在毛细管内壁吸附以及电流增大可能是基线噪音增加，灵敏度下降的原因。综合考虑分离度、基线噪音及迁移时间，本试验选择 CTAB 浓度8mmol/L 为最佳用量。 图1 栀子、芍药药、丹皮酚的迁移时间随 CTAB 浓度变化趋势图 Fig.1 Effect of the concentration of CTAB on migrationtime of jasminoidin， paeoniflorin and paeonal 1-栀子苷；2-芍药苷；3-丹皮酚 2.2.3 有机改性剂的选择 有机改性剂的种类和体积分数对电泳的分离效果有很大的影响。本实验考察了甲醇、乙腈等有机溶济。实验发现，以乙 腈产生的基线噪音较甲醇高。因此，选用甲醇作有机改性剂。还考察了甲醇的不同体积分数(1%~10%)对栀子苷和芍药苷分离度的影响，发现随着甲醇体积分数的增大，栀子苷、芍药苷和丹皮酚的迁移时间延长，分离度增加，但是体积分数超过2.5%后分离度不再增加。同时，基线噪音随其体积分数的增大而迅速增加，迁移时间延长，综合考虑，本实验选择2.5%的甲醇为最佳用量。2.2.4 NaOH溶液的浓度 缓冲体系的pH对电泳行为有很大的影响。本实验通过改变的NaOH的浓度来表示并调节缓冲体系的pH，考察了NaOH浓度(1~8 mmol/L)对测定的影响。实验结果表明， NaOH浓度对栀子苷的峰形、峰分离度及迁移时间影响较小，但对芍药苷、丹皮酚的峰形与迁移时间有较大的影响。当 NaOH浓度超过4mmol/L时，丹皮酚的峰形展宽，这可能是由于CTAB 为阳离子表面活性剂，易被毛细管壁吸附，pH降低时，毛细管表面硅羟基的解离被抑制，从而减少了样品的吸附。因而本试验选择在NaOH浓度为4 mmol/L时进行电泳测定。 2.3 分离电压的选择 实验考察了电压为10~25 kV的效果，发现电压低时，基线稳定，但样品的分析时间长，峰形宽；随着电压的增加，样品的分析时间缩短，峰形窄，分离效果好，但基线的稳定性略有下降，基线噪音增大。为保证较短的分离时间和较好基线，本试验选用15 kV分离电压。 2.4 工作曲线 按上述优化条件进行栀子苷、芍药苷及丹皮酚对照品的毛细管电泳分离，其电泳谱图如图2。 图2 对照品电泳图谱 Fig.2 The electropherogram of control samples1-栀子苷；2-芍药苷；3-丹皮酚 取栀子苷标准贮备液(100 ug/mL)稀释为20、40、60、80、100 pg/mL的标准溶液。按实验方法，对不同浓度的栀子苷标准溶液平行测定5次，得平均峰面积与质量浓度(ug/mL)线性方程及相关系数：y=36.31p-64.806，r=0.9938，线性范围为：20~100 ug/mL； 取芍药苷标准贮备(360 ug/mL)稀释为5、10、20、40、80 ug/mL的标准溶液。按实验方法，对不同浓度的芍药苷标准溶液平行测定5次，得平均峰面积与浓度(ug/mL)线性方程及相关系数：v=122.45p-211.26，r=0.9989，线性范围为：5~80ug/mL； 取丹皮酚标准贮备液(520 ug/mL)稀释为2、4、8、12、20pg/mL 的标准溶液。按实验方法，对不同浓度的丹皮酚标准溶液平行测定5次，得平均峰面积与浓度(ug/mL)线性方程及相关系数，结果如下：y=1274.8p+1131.3，r=0.996，线性范围为：2~20ug/mL。 3 样品测定和回收率实验 根据加味逍遥丸的质量控制指标，用本方法对样品进行测定，将加味逍遥丸提取液，平行测定5次。经计算，在加味逍遥丸提取液中栀子苷、芍药苷和丹皮酚的质量分数分别为：14.492.05 mg/g 和502.5 ug/g， 样品电泳谱图见图3.按照实验方法进行回收率实验(见表1)，由结果可知，栀子苷、芍药苷和丹皮酚的回收率均在97.1%~101.8%之间， 其 RSD 均小于4.4%。 图3 样品电泳图 Fig.3 The electropherogram of samples 1-栀子苷；2-芍药；3-丹皮酚 表1 回收率实验结果 Tab.1 Results of recovery test 分析物 加标量 测出量 RSD/% 回收率 p/(ug/mL) /(ug/mL) (n=5) /% 30 30.1 2.9 100.3 栀子苷 40 40.0 1.7 99.9 50 49.5 4.4 99.0 10 10.0 1.6 100.2 芍药苷 20 19.9 3.3 99.5 40 40.7 3.9 101.8 8 7.85 2.9 98.1 丹皮酚 10 9.91 2.7 99.1 12 11.7 2.9 97.1 ( 参考文献 ) ( 1 Mitsuyoshi Okamoto， K iyokatsu Jinno， T akeshi Omori etal. J Chromatogr A， 1987，407： 3 14 ) ( 2] 刘义梅.湖北中医杂志，2005，27(7) ： 52 ) ( 3]Jianwen Zhao， W e nbin Yan. Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis， 2005，38： 5 71 ) ( 万伟中，刘志辉.时珍国医国药；2002，13(6)：355 ) ( 周 欣，杨文业.药物分析杂志；2005，25(7)，784 ) ( 5] 翟海云，谭学才，陈才光等.色谱；2005，23(2) ： 212 ) ( Ke Y u， Y urwen W ang， Y r -yu Cheng. Journal of Pharmaceatical and Biomedical Analys i s， 2006，40(5)： 1 257 ) ( 181 Hsin kai Wu， Shuennrjyi Sheu. J Chromatogr A， 1 996， 753(1)：139 ) ( [91 Hsinkai Wu， Wurchang Chuang， Shuennrjyi Sheu. JChromatogrA， 1998， 803(1)： 179 ) ( [101 邓延倬，何金兰编著.高效毛细管电泳，北京：科 学出版社，2000，27 ) ( [111 国家药典委员会编，中华人民共和国药典(一部)， 北京：化学工业出版社，2005，428 ) Studies on separation and determination of Jasminoidin， Paeoniflorin and Paeonol by high performance capil-lary electrophoresis LI Li jun*， FENG Jun， HUANG Wen-yi’， ZHONG Zhao heng， WU Jian-ling’and KONG Hong xing(1. Dep-artment of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006； 2. College ofChemistry and Chemical Engineering ， Guangxi University，Nanning 530004)， Fenxi Shiyanshi， 2007， 26(5)： 38~41 Abstract： A new method for the simultaneous determination of jasminoidin ， paeoniflorin and paeonol by capillary electrophoresis has been proposed. The operating buffer medium was 8 mmol/L CTAB and 4 mmol/L NaOH. The separa-tion voltage 15 kV， the UV detection wavelength 234 nm. The linear ranges of the method were 20~100 ug/mL(r=0.9938) for jasminoidin ， 5~80 ug/mL (r=0.9989) for paeoniflorin and 2~20 ug/mL (r=0.996) for paeonol.The recoveries were 99.00%~100.27%，99.49%~101.83%，97.11%~99.06 % respectively. The new methodis simple， rapid and accurate and had been successfully used for the determination of jasminoidin， paeoniflorin andpaeonol in jiawei xiaoyao pills. Key words： Capillary electrophoresis； Jasminoidin； Paeoniflorin； Paeonol； Jiawei xiaoyao pills —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net