药物中未知有关物质检测方案

HPTLC 食品安全解决方案平面色谱的全球领导者 高效薄层色谱实践 三三面三 从左至右： G. Goncalves， A. Carminati 和M. Nimod 在位于法国南部城市锡斯特龙的赛诺菲-安万特制药工业事务部的分析研发机构(SRDA) ，分析化学家Muriel Nimod， Gilbert Goncalves和Alain Carminati负责对新药的中的药物活性成分的分析方法进行开发和验证。除了其他方法外，他们采用HPTLC串联质谱用作对药物合成过程中产生的相关物质的快速鉴别。 介绍 在过程控制中，如果HPTLC检测出一个新的不纯物质，那么整个生产过程将为了鉴别未知物而进行中断。 通常鉴别不纯物质使用的是HPLC/MS设备。但在这种中况下，将HPLC测得的色谱峰与HPTLC的结果进行准确比对或者将相关物质的斑点从薄层板上刮下再洗脱注入HPLC/MS系统进行分析都 是非常耗时的。 因此及时解决这一问题的惟一办法就是直接在薄层板上鉴别不纯物质。于是一个名为ChromeXtractor的即插即用的萃取装置被用来串联在任何HPLC/MS系统中，从而可对任何未知成分在1分钟之内进行萃取和MS检测。 过程控制中的HPTLC方法提示一个未知的不纯物质 供试品溶液的制备 将合成的样品溶解于甲醇中，浓度为5 mg/mL。 薄层板 HPTLC 硅胶60 F254 铝箔板(Merck)， 20 x10 cm，使用前用展开剂预洗一遍。 点样 CAMAG ATS4全自动点样仪进行点样，条带宽度6mm，轨道间距8 mm， 距离底边10 mm。 色谱条件 在20x10cm双槽展开缸中以正丁醇-水-乙酸(3：1：1)进行展开。 色谱后衍生化 以10%硫酸甲醇溶液，用TLC显色喷瓶对薄 HPTLC-MS联用 在UV 366nm下数个显荧光的未知物斑点被标定出来。为了将未知物从硅胶固定相中萃取出来，将薄层板置于ChromeXtractor (ChromAn， Holzhausen，德国)萃取头下并定位和压紧，然后通过HPLC泵用甲醇-%.1甲酸(9：：11)做溶剂以0.3 mL/min的流速对未知物进行萃取。 编者注：该接口的升级的正式版本自2009年起由CAMAG公司推出。 打开萃取装置的阀门后，斑点被直接洗脱并注入质谱仪。采用配备有ESI离子源接口的Finnigan LTQLC-MS(赛默飞世尔)分别以正/负离子模式在线性离子阱中进行了2级质谱和3级质谱分析。MS参数为：电离电压 4.0kV，毛细管电压27V，毛细管温度300℃，干燥气流5AU， 雾化气流10 AU。 结果和讨论 下列离子簇被ESI正离子模式所记录： [M+Na+ →385.3 M+2Na-Hl+ →407.4 M1+Nal+ →433.3/435.3 在ESI负离子模式下记录的离子簇信号较强： CAMAG CBS 101 中文版(2008年9月) 层板进行喷雾，然后于TLC薄层加热装置上以120℃加热15 min。 目前由ESI正/负离子模式下检测到的m/z385 和433的2个未知物在色谱中是一起流出的。采用MS"进一步鉴别未知物， 2级质谱显示m/z385的第1个成分的离子产生[M+Na-HF]+→365碎片峰，并在MS3中生成[M+Na-HF-CH3]+→350碎片峰。 2级质谱显示m/z 433的第2个成分的离子产生[M+Na-HF]+→413碎片峰，并在MS3中产生下列碎片峰： 通过HPTLC检测到的未知物斑点最终被证实为2个不纯物质，其中一个为主药的醛基衍生物(R-CHO，M = 362 g/mol)，另一个为氯化酮基衍生物(R-CO-CH2CI， M = 410 g/mol). HPTLC-MS串联技术的方法非常有价值，因为鉴别合成过程中的新出现的相关不纯物质必须在相当短的时间内完成。在HPTLC-MS中，从化合物的斑点洗脱到质谱结果分析仅需不到1分钟的时间。现在终于不再需要针对HPTLC鉴别中发现的不纯物质来繁琐地开发HPLC/MS鉴别方法了。 该方法被证明适用于日常的药物合成的过程质量控制中。 更详细的资料可向作者索取： *Alain Carminati， Analytical Research and Development Department， Sanofi-Aventis， Chemin de Meteline， 04200 Sisteron， France， Tel. ++33-492333955 alain.carminati@sanofi-aventis.com CAMAG CBS 101 中文版(2008年9月) CAMAG TLC-MS 薄层质谱接口 --化合物快速提取并在线传输到各种质谱仪如APCI-MS，APPI-MS 或 ESI-MS 为什么需要薄层质谱接口? 调查显示不是所有的样品都可以在 HPLC-MS或 HPLC-DAD 得到检测，这是因为化合物或相关不纯物质在紫外区没有吸收或灵敏度很低，又或者样品基质污染严重以及缺乏合适的MS溶剂。另一方面，高效薄层色谱 HPTLC 是一种分离样品的快速和简便的方法。在过去未知成分从薄层板上刮去下来，洗脱到试管中再注入质谱仪.现在一个便利的和通用的薄层质谱接口问世了，其能够半自动地提取感兴趣的斑点区域，并且直接在线输送到任何品牌的液-质系统中。 接口可快速和方便地连接到现有的液相色谱-质谱系统中且不需要任何调整和配件添加。感兴趣的物质直接从薄层板上提取下来，每个成分在一分钟内可获得足够灵敏的质谱信号。接口依靠较宽的提取头，使得成分条带可完全提取以获得检测限为pg 水平的检测结果。该接口已经被证实是最可靠的通用型薄层质谱接口。 详细信息请访问： www.camag.com/TLC-MS HPTLC-化学原料药(API's)分析中的问题解决技术 Clare McKinlay Clare McKinlay是一位在坐落于伦敦近郊的葛兰素史克药厂化学开发部(GSK， Stevenage) 工作的分析化学家。在从事新的化学单体的研发过程中，她一直采用平面色谱法来对不同项目开发阶段所遇到的大量新情况进行研究，包括从候选化合物的筛选直至新药的申报和上市阶段。鉴于McKinlay女士所取得的一些成绩，该部门现在开始逐步意识 到采用该项技术所带来的好处。 介绍 在葛兰素史克的研发部门， HPLC和GC通常是在分析起始原料，过程中间体和原料药(API’s)时常用的色谱方法。虽然该部门也拥有HPTLC设备，但并未纳入常规分析之列。然而该技术被证明是对于各种问题的理想解决方案，并且能够与其他色谱方法互为有益的补充。 实例1：某化学原料药样品由于光降解造成的质量损失的调查 在一次药物的稳定性考察中，发现了样品由于光照降解造成的含量的不一致现象。HPLC检测发现了含量测定的结果偏低，但将所有不纯物质的含量测定结果相加的总和仍然低于损失量。因此采用HPTLC以分析是否能检测到新的相关物质，从而解释所观测到的结果。 薄层板 商品HPTLC 硅胶G60F254薄层板( Merck ) ， 20 x 10 cm。以甲醇展开一次进行预洗并在80℃干燥15 min。 供试品溶液的制备 在样品中加入乙酸乙酯溶解，制成15 mg/mL的浓度。点样 采用CAMAG ATS4进行条带状点样，点样体积为2 uL。 色谱条件 展开在CAMAG水平展开仪中进行，展开剂为乙酸乙酯-庚烷(9：1)。展开距离自底边起50 mm。展开后的薄层板在CAMAG TLC加热器上进行干燥。再使用四氢呋喃展开第2遍，以便将合成的低聚物推离点样原点位置。第2次展开后，只有新的光降解产物仍停留在原点。 结果和讨论 薄层板在CAMAG TLC Scanner 3上以240 nm薄层波长进行扫描，并在254nm下采用成像系统进行拍照，以显示稳定性样品和对照样品之间的区别。 由于HPTLC具有使样品中所有成分都可能在薄层板上得到检测的能力，因此此处清晰地显示出一个在对照样品中不存在的新的不纯物质出现在降解的样品中。 第1次展开(左)和第2次展开后的HPTLC 薄层图谱局部； 1)对照样品轨道， 2) 保存72小时后的样品；3)经过21天光照的样品 本方法测得结果中该相关物质的含量为2%，为项目组提供了非常有价值的信息。更进一步的不纯物质的调查通过制备薄层和质谱仪联用完成。 编者注：薄层板点提取接口的升级版本，已由CAMAG公司在2009年推出。 该接口可直接连接高分辨率质谱，每次可鉴别一个未知成分斑点(通过直接将未知物从薄层板上洗脱)。 实例2：某化学原料药样品颜色差异的研究 在另一个新药项目的开发过程中，观察到不同批次的某化学原料药样品存在色泽差异。但在HPLC相关物质指纹图谱中并未观察到图谱的区别，其他分析方法也都给出了一致性的结论。因此HPTLC技术被用来对偏黄色的羊皮中可能存在的新的相关物质进行检测。HPTLC技术所具有的可检测所有板上所分离成分的优势被再次利用。 薄层板 商品HPTLC NH2 F254薄层板(Merck ) ， 10x10cm。以甲醇展开一次进行预洗并在80℃干燥15 min。 供试品溶液的制备 样品溶解于甲醇中，制成2 mg/mL的浓度，即得。 点样 采用CAMAG ATS4进行条带状点样，点样体积为4 pL。 色谱条件 展开在CAMAG水平展开仪中进行，展开剂为甲醇。展开距离自底边起60 mm。 结果和讨论 具有色泽差异的不同样品以及一个发生高度颜色反应的样品被一起分析。HPTLC清楚地显示一个黄色条带出现在有色的原料药样品中，而对应位置的无色样品不存在该条带。这解释了颜色的差异并找出了所感兴趣的新的相关物质。该成分在366nm下显示暗蓝色荧光。 空白轨道(1)、白色API(2)、黄色API(3)以及有色杂质提取物的HPTLC薄层图谱局部 该新的不纯物质被进一步从薄层板上萃取下来以进行质谱结构解析。该HPTLC洗脱方法也迁移到了以制备不纯物质为目的的固相萃取方法中。 结论 上述所展示的实例说明HPTLC能够用做问题解决的工具，并可在分析特定化合物时成为HPLC和GC方法的有力补充。采用HPTLC技术所获得的信息对于新药研发的某些环节是相当关键的。HPTLC技术再次被证明在现代药物分析实验室中拥有当之无愧的一席之地。 更多资料可向作者联系获取： *Clare McKinlay， Analytical Sciences， GlaxoSmithKline， ( Medicines Research Park， G unnells Wood Ro a d， St e venage， Hertfordshire ， UK ， SG1 1WZ， Clare. 2 .mckinlay@gsk.com ) CAMAL 瑞士卡玛中国技术支持中心 北京办事处 地址：北京市建国门内大街8号 中粮广场B座1426室(100005) 电话：010-65278522，65278582 传真：010-65283903 E-Mail： info@Nikyang.com 上海办事处 地址：上海市南京东路800号 新一百大厦15楼F座(200001) 电话：021-63511828，63523826 传真：021-63511931 E-Mail： info@nikyang.com 广州办事处 地址：广州市越秀区白云路111号 白云大厦1111室(510100) 电话：021-83292451 传真：021-83292510 E-Mail： info@nikyang.com CAMAG CBS 中文版()