中药指纹图谱中薄层色谱分析应用检测方案

Rf 厚朴及其饮片指纹图谱的积分数据 薄层色谱在中药指纹图谱分析的应用研究 谢培山psxie2002@hotmail.com 当前中药质量控制模式是模仿化学合成药物的模式，即以已知的某一单一活性成分或有效成分为控制质量的指标，_给以定性和定量的分析借以判断药品是否“合格”。了半个多世纪没有改变，只是分析手段的更新和测定指标的更迭。这种线性思维取向的质量控制模式，i适合于构效关系清晰、靶点明确的以单一活性成分组合的药物的质量控制。 ·至今中药质量控制模式以中国药典为代表基本 上是沿着化学药品质量控制的模式，参照国外 植物药的质量标准，，：选定中药的“有效成分” 6活性成分”或“指标成分”，建立相应的理化鉴 别，以后又发展到以光谱、色谱为主的鉴别和 含量测定的质量标准。历版药典保证了中药及 其工业产品的基本质量。 发展中国家对传统医药的共识 最近WHO 西太平洋地区讨论的“传统医学地区战略草案”指出：传统医学疗法与产品面临标准化的多重挑战。例如草药在许多重要方面有别于化学合成药物。草药通常包含大量的化合物，而非一种单独的活性成分；一般并非所有的草药活性成分都被分离、描述和量化；一种或几种草药混合的效果取决于一种或几种草药混合后的药理活动；甚至一种植物也不是一个纯粹单一的化合物；常规的控制单体成分的技术可能不适用于复杂的草药。这就需要对现有的一些规章制度进行一些调整，，需要本地区国家间相互合作，使得对草药的标准化控制达到协调一致。 中药属于天然药物，.本质上与其他国家的天然药 物没有区别，它之所以姓“中”，J正式因为它被约 束在中医的辨证论治、天人合一、整体宏观等系 统的理论体系的框架'内，具有明显的非线性特 点。中药的任何单一成分不可能代表该中药的内 在质量，也不是多种成分活性的简单相加，因为 不是单一的直接的'药”靶'对应，尤其是复方制剂 更是如此。由于它的哲学基础和中医的思维方 式，决定了它和西药有本质的不同，甚至也有别 于其他国家的传统天然药物。 传统中医药的学术思想和思维方式 人类的远古时期和古代社会就已经用混沌的整体性和朴素的整体性思维方式去认识世界。中国古代朴素的整体观，强调整体的和谐与协调。殷周时期的“阴阳八卦”说，把自然界看作是由许多部分组成的有机整体。这种整体性的思想在中医理论中有深远的影响，形成了辩证施治的优良传统。耗散结构理论的创始人普利高津指出，中国传统的学术思想着重于研究整体性和自发性，研究协调和协同。他认为现代科学技术的发展“更符合中国的哲学思想”，并预言西方科学和中国文化对整体性、协同性理解的很好结合将导致新的自然哲学和自然观。 传统中医药的学术思想和思维方式 ·应认识到人类思维方式经历了一个由低级向高级发展的复杂的历史过程，从远古时代混沌的整体性思维方式，到古代朴素的整体性思维方式，再到近代机械的整体性思维方式，于19世纪下半叶发展到高级的阶段-辩证的整体性思维方式，20世纪以后又发展到具有鲜明的信息时代特征的更高级的系统思维方式。与古朴的中医传统学术思想和理论相比有了质的飞跃。 信息时代思维方式的表现 G信息时代最具代表性的现代思维方式表现在： 信息反馈：强调互为因果的双向联系， 系统思维：突出了思维的统一性； 不确定思维：反映科学的真实性，因为事物总是存 在着随机性和模糊性，而并不总是非此即彼； 全方位思维：包括顺向与逆向、逻辑与非逻辑、收 敛与发散，，甚至求异的思维方法。 审视线性质量控制模式的不足 非线性(Non-linearity)和不确定性(Uncertainty) 是中医药的特点，这也正是从还原论出发，以线性思维形成的西方医药学难以接因受的。此用线性分析的思维和手段模仿西药质量控制的模式解决非线性的中药质量控制问题越来越显露出它的不足，在现行的质量标准中甚至执行起来有许多矛盾之处。 不能用线性分析的思维对待非线性性质 的问题。 处理确定性事物的方法解决不了具有不 确定性事务的问题。 不同思维的协调和宽容 一般分析工作者由于长期形成的线性思维定势 难以接受“模糊”和 66不确定”的概念。长期从事化学药品的分析家， 更加视“模糊”与“不确定”如水火而不相容。 处理确定的信息和 譬如制订药品的检 查和含量测定指标时，规定“不得少于”不得高 比移值)也是在绝对值难以解决实际问题时，很 自然地选择，只是明确提出，_却难以接受。 指纹图谱分析是事物发展的必然 因此，用非线性的思维，，乡综合、宏观的 分析模式解决天然带有不确定性的中药 的质量控制问题是势所必然。 在现阶段，指纹图谱分析是在上世纪很 多学者做国许多尝试，而自然发展适应 现在我们对中药的理解的一种全新概念 的质量控制模式。 中药色谱指纹图谱的特点与属性 中药指纹图谱是借助于波谱(光谱)或色谱技术获 得的中药(主要是植物药)次生代谢化学成分的光 谱图或色谱图，二者各具特色。中药指纹图谱分 析是一种非线性特点的质量控制模式，针对中医 理论指导下的中药方剂(多为复方)有效成分复杂， 非任何单一活性成分所能表达，也不是多个化学 成分作用的简单加合的特点。·鉴收别、量化评估的功能，戶 由于色谱兼具分离、 所以当前较为普遍应用 的是色谱指纹图谱。 中药色谱指纹图谱的特点与属性 色谱指纹图谱强调的是多个色谱峰(或图像中的 条斑)以相对稳定的比例关系、位置、顺序以及 在图谱中相互制约的综合的完整的色谱特征。不 同品种应有各自专属的指纹图谱。 色谱指纹图谱是以它的整体信息使中药的内在质 量可视化；所以它的最基本的属性之一是“整体 性 植物药的代谢产物因时、因地而异，)，个体之间不 可能完全相同，在共同特征的基础上个体之间的 差异构成指纹图谱的第二个属性-“模糊性” 中药色谱指纹图谱的特点与属性 中药成分复杂，所以指纹图谱不强求全部的成 而是从色谱的整体 特征来综合地鉴别真伪，加上量化参数还可以 大致评价中药产品质量的稳定性和一致性。 质量控制模式的转变首先要求思维方式的质的 转变。不应囿于“分解”和“精确”的思维定势来 处理“整体”和“模糊”的指纹图谱。.0 现阶段的指纹图谱，其主要作用是检测 和评价商品质量的是否一致和稳定，)解 决长期以来中药质量‘不可控'问题。 当前对已上市商品注射剂实施指纹图谱控制质量，是在承认其前期研究和临床疗效的基础上的权宜措施，因为从监督管理部门的角度，总要有一个开始- 在新药研制阶段，.原料精选-工艺创新一指纹 图谱评价-药效比较实验-临床验证相结合， 指纹图谱通过全过程的监控，可以起到保证质 量的作用；i产品，现在是后续指纹图谱研究和实施，功能只能是促使生产厂家注意药材、的规范化；监测批间产品和不同厂家产品质不稳定和一致和比较产品之间在总量上明显的差异. 经过同类产品不同生产厂家的生产全过程的调 查相结合，方可评价它的指纹图谱能否反映其 优良的质量。 中药色谱指纹图谱的作用 中药指纹图谱的发展趋势将随着人们认识的深化、分析技术的快速发展和计算机功能的日益强大以及中药药理、生化和临床研究与中医理论的逐渐逼近和融合做到谱效结合，使指纹图谱从质量“可视”逐步做到“谱”效”一致。”但这将涉及多学科的共同努力和对中医药传统理论和实践的深刻理解，这将是远期的目标，不能指望一蹴 而就。 中药色谱指纹图谱的可持续发展 作为中药质量标准，应注意中药指纹图谱研究和实 施的普遍适用性和可持续性，扎实稳妥地进行，=水 平逐步提高，勿摳苗助长，勿见异思迁，稳步前进， 逐步提高和完善，也就是指纹图谱有一个可持续性 发展的问题。 ●工现有的色谱分析技术对中药材这样复杂而带有模糊 性的个体的解析仍然有它的局限，「随着分析技术的 发展和分析技术的互补和融合，必将经历一个由表 及里、E由浅入深、由‘模糊'到清晰'的探索过程。 中国药典[一部]1990年版以后的中药薄层色谱鉴别特点 自1990年版以来在中药薄层色谱鉴别项下增加对照药材，以完整的色谱图像参照，解决了靠单一化学对照品不能准确解决品种的真伪，，没有化学对照品又无法检验的难题，而且所获得的整体特征的图像较单一化学对照品的专属性和质量信息要强得多。 中药薄层色谱的鉴别已具备指纹图谱的雏形 其后的新药研究也普遍采用对照药材，并被大面 积普及。 用对照药材的整体色谱图像的特征鉴别药材的真 伪已是指纹图谱的雏形，为当前研究实施中的逐 步成熟起来的色谱指纹图谱奠定了基础； 因此，可以说指纹图谱是中药质量控制模式由“点i 到“面”、、由线性到非线性、由“分解”到“综合”的自 然发展。 中药薄层色谱鉴别举例 日 白芍 贝母 柴胡 刺五加 穿心莲 陈皮 黄连 知母 山茱萸 薄层色谱在中药鉴别的优势 薄层色谱指纹图谱的应用·GAP基地中药材的品种及品质鉴别；市场药材商品的品质评价；中药饮片的质量评价和加工炮制的监测生产原料的品质保证；生产工艺过程的品质监测；中中成药产品稳定性及一致性的考察、检测和评价。 薄层色谱指纹图谱应用-人参类 人参、i西洋参、三七的薄层色谱指纹图谱显示出三者的共性(均为Panax属植物的根)，又揭示了三者的差异。 薄层色谱指纹图谱应用-人参类 400[mV/10 Flu 700【m】 3种人参属药材整体的色谱指纹图谱各有特征，足资 鉴别。 三七叶 白芍原条及饮片 饮片 提取物颗粒 白芍总苷及芍药苷的积分值比较Track 3：原条、5：饮片、6：提取物颗粒说明饮片及颗粒生产中均有明显的成分损失 总积分面积 芍药苷面积白芍原条： 5621.4(100) 788.1(100)白芍饮片： 3139.3(55.8) 485.1(61.5商品白芍 918.8 (16.3) 199.1 (25.33)提取物颗粒 薄层色谱指纹图谱应用-厚朴 厚朴原药材及饮片 原药材 Track 11 Peak Max. area Subst # Rf H [%] A [%] Name 1 0.163 1113.5 10.11 12250.1 10.61 2 0.203 2533.5 23.00 29195.2 25.30 hinokiol 3 0.263 2320.4 21.07 29409.2 25.48 magnolol 4 0.321 185.6 1.69 1218.6 1.06 5 0.396 912.8 8.29 10503.2 9.10 6 0.444 1315.5 11.94 10247.8 8.88 7 0.496 189.7 1.72 1032.6 0.89 8 0.541 359.1 3.26 2998.9 2.60 9 0.607 1302.7 11.83 15038.2 13.03 10 0.709 780.9 7.09 3522.0 3.05 Total Height 11013.8 Total Area： 115416 Track 12 Peak Max. area Subst # Rf H [%] A [%] Name 1 0.150 351.7 14.00 4043.7 14.98 2 0.195 1004.7 39.98 12328.8 45.68 hinokiol 3 0.256 5849 23.28 4678.2 1733 magnolol 4 0.396 571.7 22.75 5937.7 22.00 Total Height 2513.01 Total Area： 26988.4 图像总积分值及厚朴酚与和厚朴酚的积分值均显示该饮片成分丢失严重 薄层色谱指纹图谱应用-枸杞子 枸杞子及提取物颗粒 个 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 (~配方颗粒) beta-sitosterol scopoletin β-谷甾醇 D：\3-Book\VideoScan\g-枸 (x1000) uw Track1 东莨菪汀 Track 2 uw Track 3 Track 4 5 Track 5 3u Track 6 4 3uw Track 7 o Track 8 Track 9 3 3 Track 10 uw Track 11 2 Track 12 wTrack 13 1 枸杞子提取物颗粒(成分严重 0 1损失) 0.0 0.1 C0.20.30.440.50.60.70.80.91m 4 薄层色谱指纹图谱应用-麦冬、山麦冬 T r k 1 Trk 5 Trk 5 麦冬 山麦冬 山麦冬与麦冬皂苷成分指纹图谱截然不同，二者是否等效，值得研究33 监控人参制剂工艺及最终产品的质量 - other ingredientin the formula Rg1 Re Rb1 00 70 340 510 88D 851 1320 119D 1380 530 [mm] 人参及其复方制剂薄层色谱图像及数码扫描图谱 1，对照品 (Rb1+Re+Rg1)； 2，人参根；3，人参提取物；4，5，复方制剂产品 注射用JL皂苷薄层色谱指纹图谱 药材 提取物 成品 注射用JL皂苷薄层色谱指纹图谱 (x100) 蒺藜草味甾皂苷甲 (x100) 35 Track 12-16 35 7 蒺藜卓螺甾皂苷甲 3 对照品 2 9 药材 6 8 5 提取物+对照品 0 0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.00.1 0.2 0.3 0.4 0 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 成品 注射用JL皂苷薄层色谱指纹图谱 注射用JL皂苷薄层色谱指纹图谱 10批药材指纹图谱的全谱相似度分析结果 编号 相关系数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 相关系数(中位数) 0.9886 0.9915 0.9870 0.9836 0.9903 0.9765 0.9577 0.9848 0.9627 0.9715 相关系数(均值) 0.9849 0.9917 0.9874 0.9812 0.9877 0.9810 0.9639 0.9876 0.9705 0.9765 相合系数(中位数) 0.9928 0.9947 0.9907 0.9895 0.9939 0.9835 0.9739 0.9905 0.9768 0.9819 相合系数(均值) 0.9905 0.9948 0.9907 0.9879 0.9923 0.9862 0.9778 0.9924 0.9818 0.9852 注射用JL皂苷薄层色谱指纹图谱 半成品薄层色谱指纹图谱相似度评价的叠加图及数据 注射用JL皂苷的全谱相似度分析结果 注射用JL皂苷的全谱相似度分析结果 批编号相关系数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 相关系数(中位数) 0.9781 0.9970 0.9949 0.9972 0.9968 0.9965 0.9835 0.9972 0.9955 0.9978 相关系数(均值) 0.9823 0.9969 0.9964 0.9969 0.9977 0.9959 0.9884 0.9969 0.9936 0.9970 相合系数(中位数) 0.9856 0.9981 0.9968 0.9982 0.9979 0.9978 0.9896 0.9980 0.9972 0.9986 相合系数(均值) 0.9882 0.9981 0.9977 0.9980 0.9985 0.9974 0.9927 0.9977 0.9960 0.9981 注射用CSRS薄层色谱指纹图谱 原料药材CS及其提取物薄层色谱图(左)及扫描图(右) 注射用CSRS薄层色谱指纹图谱 00 01 原料药材RS及其提取物薄层色谱图(左)及扫描图(右) 注射用CSRS薄层色谱指纹图谱 原料药材 旧工艺提取物 指纹图谱监控工艺过程(旧工艺成分损失严重) 注射用CSRS薄层色谱指纹图谱 0D 170 340 510 68D 850 1020 118D 1350 153D [mm] 新工艺保留原料药材中的活性成分良好 成品薄层色谱指纹图谱的相似度评价，，才相关系数>0.95 薄层色谱指纹图谱标准书写格式 【指纹图谱 参照薄层色谱法(中国药典一部附录ⅥB)结合指纹图谱的要求进行测定。技术参数参照相应格式书写，说明薄层板类型、点样方式、色谱展开用溶剂系统、展开时环境温度及相对湿度、展开距离、显色及观察方法、图像记录、扫描方式、特别主意事项等·其余参照液相色谱法相似格式书写。 薄层色谱指纹图谱研究注意事项供试品溶液的制制：必须的样品预处理；预制薄层板：保证板的质量和洁净；点样方式：条带状或圆点状(器械协助)；展开剂：优选展开剂；对照品或对照药材展开时的环境条件：温度、：相对湿度；图谱记录；重现性问题： 关于薄层色谱的重现性 在欧洲和中国的两个实验室用同样的条件所做的同样的样品分别得到的薄层色谱图有极好的重现性。关键是材和操作的规范化。