磷脂类化合物中含量检测方案(薄层色谱仪)

薄层色谱应用报告 A.52.3磷脂类化合物的 HPTLC 含量测定 本文所采用方法的优点： 简便的样品前处理方法 ●AMD 色谱可获得高分离度 ·待测成分的极性分布范围宽 可同板比较许多样品的图谱 灵敏的ng级定性/定量检测限 ·可用于任何来源的磷脂样品分析 关键词： 目的： 磷脂类化合物的分析在生命科学及食品科学中非常普遍。磷脂是细胞膜结构的主要组成部分，也是靶向制剂的重要辅料。在食品工业作为乳化剂用以稳定天然或合成的混合物制品，如软饮料和肉类制品等等。通过鉴别乳化剂的组成成分，就可以根据该指纹图谱来确定产品的厂家品牌。 磷脂和脂类的区别在于前者的分子中同时包含了疏水基团和亲水基团。与脂类一样，该类化合物的UV吸收很弱。采用薄层色谱法检测磷脂的优势在于可通过色谱后衍生化来对磷脂类成分进行显色观察。 不同磷脂化合物的极性差异较大，且通常与复杂的基质杂质共存。而通过AMD全自动梯度展开系统并结合色谱后衍生化，可在500 nm吸收波长处或以荧光方式对该类成分进行专属性的基于薄层色谱扫描的含量测定。 试剂： 化学对照品：神经鞘磷脂、三油酸甘油酯、胆固醇、磷脂酰肌醇、心磷脂(双磷脂酰甘油)、\十五烷醇胆固醇酯、卵磷脂。氯仿、甲醇、二氯甲烷、异丙醇、正己烷、浓硫酸、氨试液(25%)、4水合二氯化锰等分析纯试剂。 ( L C A M A G 应用报告A .52. 3中 文 版· 瑞士 卡 玛 中 国技术支持中心·inf o @ camag- c hina.com ) 供试液制备： 食品乳化剂样品制备 将25 mg油脂乳化剂中溶解于25mL氯仿-甲醇-水(70：30：5)中，过滤，滤液 置于50mL容量瓶中。用氯仿洗涤容器，加氯仿至刻度线。 生物组织样品制备 在1g生物基质中加加5 mL去离子水，以匀浆机在4℃冰水浴上均质1 min。 在1mL均质物中加入15mL氯仿-甲醇(2：1)溶液，震摇15 min， 滤过。 用15mL氯仿-甲醇(2：1)和15mL氯仿-甲醇(1：2)溶液依次洗涤容器和滤纸， 合并上述滤液，在氮气流下蒸干。以1 mL氯仿萃取残渣，作为亲脂性部位A。再 以1mL氯仿-甲醇-水(4：10：2)萃取残渣，获得亲水性部位B。 对照品溶液的制备： 取各对照品10mg，分别溶解于10mL氯仿中。精密移取各溶液1mL置于10 mL容量瓶中，加氯仿至刻度(100ng/uL)。 薄层板： HPTLC高纯度硅胶60F254预制高效薄层板， Merck， 20x10 cm。将薄层板浸入异丙醇溶液中1h进行洗板， 再于120°℃干燥30 min。 点样： 采用CAMAG Linomat进行条带状点样，条带宽6mm， 间距4 mm， 距侧边15 mm，每块板17个样品，原点距底边7mm， 点样速度4 s/uL。 食品乳化剂样品点样量6pL，不同浓度对照品适量，以制作标准曲线。生物样品部位A点样量5uL，覆盖点样组分B5uL。再将A和B分别点样。 色谱条件： 以二氯甲烷-甲醇-正己烷25步梯度为展开剂，进行全自动梯度展开。采用氨试液调节展开气相。每步3mm展距，每步间的干燥时间6 min。 图125步AMD梯度洗脱程序 步数 1 2 6 11 16 21 溶剂瓶号 1 2 3 4 5 6 甲醇 100 70 30 二氯甲烷 30 70 100 50 正己烷 50 100 干燥时间 6 min 洗瓶 1N氨水 色谱后衍生化： 显色剂：0.4g4水合二氯化锰溶于60mL水中，再加入60mL甲醇和4mL浓硫酸。使用前冷却至室温。采用CAMAG浸入装置将薄层板浸渍于溶液中5s，然后于120°℃干燥20 min。 说明：可见光下大于100 ng的磷脂组分可观察到棕色吸收斑点， 在366nm UV下的荧光检测限为10 ng。由于在此例中的成分荧光斑点不如可见光稳定，因此推荐首先采用吸收模式对样品进行含量测定，再转换为荧光模式对含量较低的样品进行测定。 光密度扫描评价： 采用CAMAG TLC Scanner和winCATS工作站软件进行薄层扫描定量分析。测定在550 nm钨灯和546nm处汞灯的吸收，狭缝尺寸0.2x5mm， 以峰高进行二阶多项式的工作曲线计算。荧光模式的扫描在366nm汞灯下进行。 图2天然乳化剂(N)样品和对照品的薄层扫描曲线 样品含(1)心磷脂 266.9 mg/g， (2)胆固醇180.0mg/g 图3合成乳化剂(N)样品和对照品的薄层扫描曲线 样品含(1)卵磷脂343.0 mg/g，(2)胆固醇106.4 mg/g. 图4动物组织样品亲脂性提取物B的薄层扫描曲线 样品含(1)卵磷脂320.0 ng， (2)神经鞘磷脂 340 ng 和(3)胆固醇300ng. 图5卵磷脂(1)、神经鞘磷脂(2)和胆固醇(3)的工作曲线(峰高，2次多项式)定量范围66.67-33.35 mg/g. CAMAG 应用报告 A.文版·瑞士卡玛中国技术支持中心·info@camag-china.com