绿茶及绿茶提取物中定性鉴别检测方案(薄层色谱仪)

高效薄层色谱实践 CAMAL 各主产国绿茶及绿茶提取物的HPTLC定性鉴别方法 作者 R. Jorns V. Widmer， E. Reich 多年以来瑞士卡玛实验室开发了许多天然产物的HPTLC定性鉴别方法。主要包括药用植物和具有重要商业价值的植物原料及其可能的掺伪品或仿冒品。正确地鉴别植物原料对于确保产品的安全性和有效性而言至关重要。有鉴于此，HPTLC技术成为了植物提取物工业最不可或缺的工具。本文的方法是在Frutarom天然植物提取物厂(Frutarom Switzerland，Ltd.， Zurich， Switzerland) 的Jorns女士协助下完成的。14年来Jorns女士为许多种草药和标准提取物开发了大量的质量控制分析方法，尤其是HPTLC方法。在Frutarom药厂，薄层色谱技术是用来进行日常分析和新品研发的重要色谱方法。在每一个项目伊始，对每一类组分的筛选就是基于HPTLC的。基于所获得的信息，继而对质量控制所需的分析方法进行开发。包括针对确定植物品种的掺伪品的一致性和纯度测试，以及成分测定。对于上述分析任务来说HPTLC作为一种简便快速的方法而言得到了广泛的应用。 简介 茶是山茶科山茶属植物Camellia sinensis茶树叶片制成的饮品，在世界各地数百年来均有广泛的消 费。绿茶是茶叶基本未经发酵(氧化)的加工品，因其所具有的保健功效而在当今愈来愈受到欢迎。如今茶叶也成为植物提取物工业的加工原料，作为食品补充剂加入规模不断扩大的各类制品中，如饮料(柠檬冰茶)、营养棒、冰淇凌乃至热门的护肤产品。面对日益严格的用于确保产品质量安全的相关法规，行业追切需要将每个产品中涉及的所有植物原料都建立鉴别记录。 为了对每个绿茶成分进行含量测定，过去5年来各类分析方法不断被发表。然而，这其中的每个单独方法不足以对产品质量进行全面地描述。因此开发了系统的针对鉴别和产品一致性的检验方法。其中包括多元酚(儿茶酚)、i黄酮类成分、氨基酸(茶氨酸)和嘌呤生物碱(咖啡因、可可碱)鉴别的HPTLC指纹图谱方法。 供试品制备 取绿茶样品(100mg)或绿茶提取物(40mg)，加10mL乙醇-水(4：1)溶液超声提取 5-10 min。离心后取上清液作为供试品溶液。各化学对照品加甲醇分分制成0.5-5mg/mL的溶液。 薄层板 HPTLC 硅胶60F254 高效预制薄层板， Merck，20 x 10 cm 点样 采用CAMAG ATS4全自动点样仪进行点样，点样体积4-6uL。条带宽8mm， 距离薄层板左侧20mm， 轨道间距最小10mm，原点距离底边8mm。 色谱条件 在双槽展开缸中进行： 黄酮类成分：甲酸乙酯-甲苯-甲酸-水(30：1.5：4：3)，层析缸饱和条件下展距70 mm. ( 多元酚类成分：甲苯-丙酮-甲酸(9：9：2)，层析缸不饱和条件下展距60 mm。 ) 生物碱类成分：乙酸乙酯-甲醇-水(20：2.7：2)，缶析缸不饱和条件下展距50 mm。 氨基酸类成分：正丁醇-丙酮-乙酸-水(7：7：2：4)，层析缸不饱和条件下展距50 mm. 衍生化和成像 采用CAMAG薄层板浸渍装置采用下列进行试剂进行显色： ● 黄酮类成分：天然显色剂(0.5%的二苯基硼酸氨基乙酯的乙酸乙酯溶液)显色，再以聚乙二醇试剂(5%聚乙二醇400的二氯甲烷溶液)固定，于UV366 nm下检视成像。 多元酚类成分：固蓝盐B试剂(0.07%的水-甲醇-二氯甲烷1：14：5溶液)，于白光下检视成像。 生物碱类成成：于UV254nm下检视成像。 氨基酸类成分：茚三酮试剂(%.2甲醇溶液)，于白光下检视成像。 以CAMAG DigiStore2系统进行图片拍摄和数字存档。 CAMAG TLC Visualizer薄层色谱成像系统 这一全新设计的薄层色谱的评价、可视化及成像存档系统是CAMAG DigiStore仪器的继承者，是知名的CAMAG Reprostar系列产品的最新组件。 ● 可拍摄UV 254 nm、UV 366 nm和可见光下的色谱图像 ( ● 强大的高分辨率12位CCD相机，具有极佳的色 彩线性范围 ) ● 全自动图像捕获、优化及背景校正功能 CAMAG TLC Visualizer和winCATS工作站软件均符合cGMP要求，可进行IQ/OQ验证，并遵守FDA 21 CFR Part 11法案要求。 通过CAMAG TLC Visualizer您可获得无与伦比的高质量色谱图，正如下图所示的一样(西番莲Passiflora提取物)。 结果与讨论 对来自中国、日本、印度和其他国家的总共80个绿茶样品进行了分析。除了绿茶外，尚包括黑茶、白茶、乌龙茶、普洱茶以及其他特殊的茶产品。 1、不同地理产区绿茶的差异区别 茶叶拥有特征的黄酮类成分指纹图谱。各样品的斑点密度差异较大，但所有样品特别是绿茶可基本归纳为3种模式，其与样品的地理产区存在相关性。大部分模式I的样品产自中国，大多数模式II样品来自日本，模式Ⅲ为印度样品。所分析的许多黑茶样品也属于模式Ⅲ。 绿茶模式I 模式I1 ▲绿茶样品的HTPLC黄酮类成分指纹图谱(不同薄层板间)展示了不同地理产区的差异。轨道1：混合对照品(Rf值由低到高)：芦丁、氯原酸、金丝丝苷和没食子酸。2-8：中国产绿茶；9-13：日本产绿茶；14-15：印度产绿茶，16-17：斯里兰卡产黑茶； 2、绿茶与其他茶叶制品类型的区别 在茶叶的炮制加工过程中，有一个规定限度的发酵(氧化)过程。多元酚的指纹图谱(主要是表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表没食子儿茶素EGC、表儿茶素没食子酸酯ECG和表儿茶素)受到一定影响。在所有测定的指纹图谱中，白茶和乌龙茶样品差异较大因此不具有代表性。黑茶样品或者不显示多元酚的斑点或者显示很强的EGCG和EGC以及微弱的表儿茶素斑点。只有绿茶样品显示所有4个成分斑点，其中EGCG最强。这种指纹图谱模式发现于所有绿茶样品中。 3、比较不同茶叶提取物的指纹图谱特征 除了上述介绍的方法外，2个其他的HPTLC色谱条件也被用来评价绿茶的成分。结果所生成的HPTLC指纹图谱可使得生产企业不仅可利用对照植物提取物(BRM)来比较原料和成品的批间差异，而且也展示出在生产过程中原料中的所有成分均转移到了成品中。 14 15 17 18 20 26▲绿茶样品的HTPLC多元酚类成分指纹图谱(不同薄层板间 展示了不同茶叶类别和地理产区。轨道1：混合对照品(Rf值由低到高)： EGCG， EGC，ECG和表儿茶素。2-5：中国产黑茶；6-9：印度产黑茶；10-11：中国产乌龙茶(样品11发酵程度很低)；12-13：中国产白茶；14-19：中国产绿茶；20-24：日本产绿茶；25-26：印度产绿茶。 编者注：由于受相对湿度的影响， EGC和ECG(中间2个斑点)在所有薄层板上的分离并不完全一致。如使用ADC2设备可对薄层活性进行可重现的精确控制，并可获得可比较的色谱图。 a b ▲绿茶及绿茶提取物HPTLC指纹图谱 轨道1：混合对照品 (Rf值由低到高)：a)芦丁、氯原酸、金丝桃苷和咖啡酸； b) EGCG， EGC、 ECG和表儿茶素；c)可可碱和咖啡因；d)天门冬胺酸、谷氨酸、茶氨酸和酪氨酸。2.绿茶对照提取物；3.绿茶提取物；4.市售绿茶产品 ( [1]E E. Reich， A.Schibli， V. Widmer， R. Jorns， E. W olfram， A. DeBatt， J Liq Chromatogr & Rel Techn 14 (2006) 2141-2151 ) 进一步资料可联系作者获取： R. Jorns， R&D Phytopharmaceuticals， Frutarom Switzerland Ltd.，Rutiwisstrasse 7， CH-8820 Wadenswil (Zurich)， Switzerland， Tel. +41 (0)44 782 65 54， rjorns@ch.frutarom.com CAMAG 全自动薄层展开仪 ADC 2 全自动展开仪可提供可重现的、安全方便的20x10和10x10 cm 的 TLC/HPTLC 薄层板及薄片软板展开步骤。在本期CBS 杂志所刊载的分析方法中，ADC 2 可用来进行苦艾、葫芦巴碱以及绿茶及其提取物的薄层色谱展开。 ADC 2 拥有许多为我们的客户所赞誉的优点： 展开过程无需任何人工监控和值守，且操作过程记录可追溯。 可单机独虫操作或由联机的 winCATS 工作站软件控制。 ADC 2 和 winCATS 软件均符合 cGMP 要求并可进行 IQ/OQ 验证。仪器可应用于 21 CFRPart 11 电子签名法案规定的环境。 最受欢迎的是其“湿度控制”单元，该选件可在任何活度的薄层板上获得可重现的色谱图。 平面色谱的全球领领导导者 CAMAG CBS 中文版·第()·瑞士卡玛中国技术支持中心·info@camag-china.com