神经酰胺中类脂成分检测方案(薄层色谱仪)

CAAL薄层色谱应用报告 薄层色谱应用报告 C.12 皮肤角质层中神经酰胺等14种类类成分的 HPTLC 分析 本文所采用方法的优点：●简便的样品前处理方法·采用 HPTLC-AMD技术获得极佳的分离度·分离时间短(150min)，溶剂消耗较低·基线分离7种不同神经酰胺及脂类及甾醇·衍生化后的神经酰胺的 ng 级检测限●可用于大量样品筛选及临床日常化验目的 关键词： 类脂、神经酰胺、胆固醇、脂肪酸、HPTLC高效薄层色谱，定量分析， AMD多级梯度展开，光密度扫描、色谱后衍生化 类脂、神经酰胺、胆固醇、脂肪酸、HPTLC高效薄层色谱，定量分析， AMD多级 梯度展开，光密度扫描、色谱后衍生化 目的： 神经酰胺类化合物是由神经鞘氨醇长链碱基与脂肪酸组成神经鞘氨脂质的一类。 神经酰胺分子结构具有二条长链烷基，一个酰胺基团和二个羟基基团，使其兼具 亲水性和疏水性。神经酰胺在包括细胞凋亡等多种诱导生物效应中起重要的信使 作用，其也参与细胞分化等多种生理及病理过程。 此外在皮肤角质层中大量存在的神经酰胺对皮肤起到了重要的屏障、粘合、保湿 及抗衰老作用，这些作用使其成为化妆品行业最重要的生物添加剂之一。同时也 可作为特别是各类皮肤疾病临床诊断的重要参考指标。 此类成分通常UV吸收较弱。通过AMD 2全自动梯度展开系统并结合色谱后衍生 化，可在546 nm吸收波长对该类成分进行专属性的薄层色谱扫描含量测定。 试剂： 化学对照品：胆固醇，胆固醇-3-硫酸盐，胆固醇油酸酯，棕榈酸，三油酸酯，角鲨 烯，神经酰胺 AS、神经经胺 AH、神经酰胺 AP、神经酰胺 NS、神经酰经 NP、 化学对照品：胆固醇，胆固醇-3-硫酸盐，胆固醇油酸酯，棕榈酸，三油酸酯，角鲨烯，神经酰胺 AS、神经经胺 AH、神经酰胺 AP、神经酰胺 NS、神经酰经 NP、神经酰胺 EOH、神经经胺 EOS。 命名方式中的第1个字母表示脂肪酸的种类，如A代表α-羟基脂肪酸、○代表w-羟 ( L C AM AG 应用 报 告C . 12中文 版 ·瑞 士卡玛中 国技术 支 持中心·inf o @ c amag-china . c o m ) 基脂肪酸，在最后1种类型中还可以酯键连接一个额外的脂肪酸。最后1个字母代表鞘氨醇的种类，如P代表植物鞘氨醇、S代表神经鞘氨醇等。 供试液制备： 皮肤类脂提取物自志愿者前臂提取。采用装有8mL正己烷-乙醇(2：1)的4cm内径烧杯，将开口压紧于皮肤表面并倒置5 min。将提取物在氩气流下于50°℃蒸干。将残渣溶于500pL氯仿-甲醇(1：1)中。 薄层板： HPTLC硅藻土硅胶60F254预制高效薄层板， Merck， 20x 10 cm。将薄层板采用氯仿-甲醇(65：35， v/v)预洗3次，干燥。 点样： 采用CAMAG ATS 4进行条带状点样，条带宽6mm， 间距4mm，每块板17个样品，原点距底边8mm， 点样速度100 pL/s。点样量样品6pL，对照品4 ug每斑点。 色谱条件： 以乙醇-丙酮-氯仿-乙酸乙酯-正己烷为展开剂，采用CAMAG AMD 2进行全自动梯度展开。共17步梯度(见图1)，极性依次降低，每步展距3mm， 干燥时间90s，采用乙酸控制展开时的气相。 乙醇 ZZZA丙酮 AW氯仿 乙酸乙酯 区Xx正己烷 -与原点的距离 图1AMD2梯度展开程序 色谱后衍生化： 采用CAMAG浸入装置将薄层板浸渍于10% CuSO ， 8%磷酸(v/v)和5%甲醇混合溶液中20s， 然后于150°C加热20 min。 ( C AM AG 应用报告 C . 12 中文版· 瑞士卡玛 中国技术 支持 中心· i nf o@ c amag-china . co m ) 光密度扫描评价： 采用CAMAG TLC Scanner和winCATS工作站软件进行薄层扫描定量分析。测定 在546nm处汞灯的吸收，狭缝尺寸0.1x4mm， 扫描速度20mm/s。各神经酰胺 的含量均以神经酰胺NP峰面积为参照进行计算。为避免误差，每块薄层板都分别 制定二次回归曲线。 结果与讨论： 结果与讨论： 神经酰胺AP对照品为半合成产物，为2个外消旋体混合物。对照品中神经经胺AS和神经酰胺AP的一个异构体未达到基线分离(图3中的第4号色谱峰)。 最后测定了角质层组织中的14种神经酰胺及类脂化合物的含量及相对比例。 图2神经酰胺等脂类的HPTLC色谱图 轨道A为脂类对照品；轨道B为人皮肤角质层提取物中的脂类，包含7个分离的神经酰胺类成分 表1类脂提取物的成分指纹图谱 脂类 脂类组成 ug/cm‘ 百分比% 胆固醇-3-硫酸盐 1.8±1.7 1.9±1.3 总神经酰胺 12.0±3.0 15.8±7.2 胆固醇 8.1±1.0 10.4±4.0 游离脂肪酸 30.4±25.2 30.2±15.0 甘油三脂 16.1±5.6 18.7±4.0 甾醇酯/蜡脂 19.3±5.7 23.0±6.0 角鲨烯 未测定 未测定 ( C AM AG 应用 报 告 C .12中 文 版· 瑞士卡玛 中国技术支持中心·inf o @ c amag-chin a .c o m ) 展开距离 图3脂类标准品的薄层光密度扫描图 山号：(2)胆固醇-3-硫酸盐、 (3)神经酰胺 AP、(4)神经酰胺 AP外消旋体+神经酰胺 AS、(5)神经酰胺 NP、(6)神经酰胺 NS、(7)胆固醇、(8)棕榈酸、 (9)三油酸酯、(10)胆固醇油酸酯、 (11)角鲨烯 图4皮肤角质层提取物中的薄层光密度扫描图 峰号：(2)胆固醇-3-硫酒盐、 (3)神经酰胺 AH、 (4)神经酰洗 AP、 、(5)神经酰胺 AS、 (6)神经酰胺 EOH、(7)神经酰胺 NP、(8)神经酰胺 NS、 (5)神经酰胺 EOS、(10)胆固醇、(11)游离脂肪酸、 (12)甘油三脂、 (13)胆固醇油酸酯 (14)角鲨烯 图5工作曲线示例 基于同板9个浓度的神经酰胺NP对照品制备，y=51255.4*X/2.4+X，相关系数0.9995 表2类脂提取物中神经酰胺的成分指纹图谱 神经酰胺 神经酰胺组成 ug/cm2 百分比% 神经酰胺 EOS 1.9±0.7 15.7±2.3 神经酰胺NS 1.7±0.4 14.1±2.3 神经酰胺NP 1.5±0.4 12.1±1.6 神经酰胺 EOH 1.0±0.3 8.1±0.7 神经酰胺 AS 2.7±0.7 22.3±1.5 神经酰胺 AP 0.9±0.4 7.9±3.2 神经酰胺AH 2.4±0.6 19.8±1.7 参考文献： [1] ( Hany Farwanaha ， R einhard Neuberta，Sebastian I Zellmerb， KlausRaitha. Improvedprocedure for the separation of major stratum corneum lipids by means of automated multipledevelopment thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B， 780 (2002) 443-450 )