费氏弧菌中生物活性检测方案(薄层色谱仪)

高效薄层色谱实践CAAMAL CAMA 经光辐照后防晒霜的原位HPTLC-费氏弧菌生物活性分析 作者(由左至右)： Dr. Urs Hauri， Vera Baumgartner， Dr. Christopher Hohl 瑞士巴赛尔一史达特州立实验室是该州对于食品、玩具和化妆品等各类生活用品质量进行法规监管的权力机构。作为非食品部门主任的Dr. ChristopherHohl，着力于分析日用消费品中的各种添加物，如保鲜剂、染料色素和紫外防晒剂 (UV filters) 等。其工作还包括针对各类有害的目标化合物开发适合的GC， HPLC以及HPTLC分析方法。最近引进的基于HPTLC-生物自发光技术的毒理学检测技术帮助该部门在筛查未知化合物时发现了数个感兴趣的具有特殊毒性的色谱成分。 简介 编者按：防晒油是为了保护人体皮肤免受UVA(波长320~400 nm) 和UVB(波长275~320 nm)的辐射损害。然而早早1997年的研究结果”即显示，-些产品配方中所添加的UV防晒剂当暴露于阳光中会发生成分降解，存在潜在危害。但有关这些降解产物的毒理学相关研究迄今未见报导。本文所介绍的方法结合了色谱分离与生物活性检测技术，能够确定防晒霜产品中光降解产物的具有专属性的生物活性。 HPTLC-生物自发光联用技术系将物理及化学的分离技术与采用发光细菌费氏弧菌 (Vibriofischeri) 的生物检测方法将融合的专属性分析技术。生物发光抑制剂可对细菌的新陈代谢造成干扰，其抑制活性的等级与其化合物毒性呈正相关。Vibriofischeri细菌自1979年起就用于生态毒理学分析，特别是水样测试(德国国标DIN 38412 L34 比色法)以及化学品测试。为了将细菌作为一种HPTLC高效薄层色谱的衍生化显色手段，需要借助Bioluminex特种试剂盒 (www.chromadex.com)。 该筛选步骤大致如下：将供试品溶液点于一块HPTLC薄层板上，采用全自动多级展开仪(AMD)进行色谱分离，在UV 254nm和366 nm进行薄层色谱成像。然后为其涂渍Vibrio fischeri培养液。待感兴趣的活性成分斑点显示之后，可额外采用HPTLC-MS接口装置或HPLC-DAD和LC-MS设备对从硅胶固定相上刮下来的每个成分进行分析。再在HPLC-DAD中对待测成分与已知的UV防晒剂成分HPLC图谱库进行比较分析。 供试品的制备 对照品的光降解产物制备：取UV遮光剂对照品，溶解于合适的溶剂中涂布于载玻片上，于人工日光设备(Atlas SuntestCPS+)中进行老化实验。再用乙醇/丙酮系统溶解载玻片上的样品。防晒霜样品的光降解产物制备：采用人工日光和自然日光照射(入夏的午后30 min， 北纬47°)方式进行。再用乙醇/丙酮系统溶解载玻片或皮肤上的样品。 薄层板 HPTLC LiChrospher 球形硅胶60F254高效预制薄层色谱板 (Merck) ， 20 x10 cm。以甲醇预洗后在CAMAG TLC板加热器于120°C加热30 min。 点样 采用CAMAG Linomat 5仪器进行条带状点样，条带宽6mm， 轨道间距10mm。原点距底边8 mm。点样体积：UV遮光剂对照品溶液25uL，防西霜样品10 pL(含UV遮光剂大约2 ug/条带)。 色谱条件 UV遮光剂对照品光降解产物：采用CAMAGAMD2系统进行展开，二异丙基醚-正己烷6步展开，无预平衡，干燥时间2-3 min， 展开距离50 mm。 防晒霜样品光降解产物：采用CAMAG AMD2系统进行展开，叔丁基甲醚-正己烷7步展开，预平衡，干燥时间2-3 min， 展开距离50 mm。 薄层板在CAMAG TLC板加热器于120°C加热30 min。 光密度法扫描 采用CAMAG TLC Scanner 3结合winCATS工作站软件进行200-400 nm的多波长扫描。 检视 采用 CAMAG Reprostar 3分别在 UV 254 nm和366 nm 下进行成像。接着进行生物测定，采用CAMAG 薄层板浸渍装置将薄层板浸 Vibrio fischeri溶液1s， 采用 CAMAG BioLuminizer 进行成像评估，曝光时间55 s. 结果和讨论 该方法的局限在于需要使用水溶液状态的Vibriofischeri溶液，因此对于选择薄层板固定相、展开剂和薄层板干燥都带来一定困难。最后确定无定形硅胶和球型硅胶固定相最能满足该亲水性生物分析所需要的水可湿性要求。对于分离过程来说，只应使用对于Vibrio fischeri细菌无毒的溶剂作为展开剂，并且在挥干后不应有残留在薄层板上。由于需要将薄层板加热挥干，因此该方法不适合于分析热敏物质及易挥发性成分。 通过分析纯对照品和化妆品样品，该技术的潜力得到了很好的展示。采用Vibrio fischeri细菌对UV防晒剂的检测获得了满意的结果。具有生物活性的成分以暗斑的形式出现在薄层板的亮荧光背景下。从发光受到强烈抑制到没有影响，其抑制效果高度依赖于UV防晒剂的种类差异。 与传统的检测手段相比，生物检测显示了与众不同的结果：：一些在色谱中具有高UV响应值的成分斑点并未观察到生物发光的改变，而另一些斑点在生物自显影图谱中则得到了很强的表达，另外也有一些成分在2种图谱中拥有基本一致的信号强度。非常有趣的一点是， UV防晒剂的生物活性强度与其分子量具有负相关性。在1998年后推出的所有新的UV防晒剂类型(分子量均大于400)， 对Vibrio fischeri基本显示抑制效应。 Substance Abbr. Molecularweight Inhibitionof Vibrio fischeri 4-Aminobenzoic acid PABA 137 strong Benzophenone-1 B-1 214 very strong Benzophenone-3 B-3 228 very strong 3-Benzylidene-camphor 3-BC 240 medium Benzophenone-8 B-8 244 very strong Benzophenone-2 B-2 246 very strong Isoamylmethoxycinnamate IMC 248 very strong 2-Ethylhexylsalicylate EHS 250 weak 4-Methylbenzylidene Camphor MBC 254 strong Homosalate HMS 262 weak 2-Phenyl-5-benzimidazole-sulfonic-acid PBSA 274 none Menthylanthranilat MA 275 weak 2-Ethylhexyl-4-(dimethylamino)-benzoate EHDP 277 weak Ethylhexylmethoxycinnamate EHMC 290 medium 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid B-4/5 308 none tert. Butylmethoxydibenzoylmethane BMDBM 310 very strong Octocrylene OC 361 very weak Diethylamino hydroxybenzoyl hexylbenzoate DHHB 397 weak 4-(2-oxo3-bornylidenemethyl) phenyl trimethylammoni-um methyl sulphate CBMS 409 none Terephtalydene dicamphor sulfonic acid TDSA 562 none Drometrizole Trisiloxane DTS 570 none Bis ethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine BEMT 627 none Disodium Phenyl Dibenzimidazole Tetrasulfonate DPDT 630 none Methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol MBBT 658 none Diethylhexylbutamidotriazone DEBT 766 none Octyltriazone EHT 823 none 此外对未经和经过光辐照的UV防晒剂对照品的对比研究揭示光降解现象发生于4-甲氧基肉桂酸-2-异辛酯(EHMC)、4-甲氧基肉桂酸异异酯(IMC)以及 4-二甲氨基苯甲酸-2-异辛酯(EHDP)等化合物。上述所有光降解衍生物较其母体而言均具有很强的抑制作用。但必须注意的是，一个UV防晒剂光降解产物的产生与其混合基质以及其他UV防晒剂的存在有很大关系。 未辐照和辐照后(*号表示)UV防晒剂标准品在薄层254nm，，366 nm和Vibrio fischeri的生物自发光图谱检测(由上至下) 因此，接下来对5种市售的防晒油商品进行了测定。对光照和无光照的防晒油提取物进行了HPTLC 以及HPLC-DAD 和LC-MS分析。大多数防晒油也都含有同样抑制细菌发光的基质类成分，如防腐剂等。2个品牌的防晒油样品显示出强烈的降解，可从UV图谱当然特别是生物自发光图谱中得到体现。对经过光辐照后的样品立即进行的仔细分析证实这些确为光降解产物。下图第1个防晒油样品含有4-甲氧基肉桂酸-2-异辛酯，叔丁基甲氧基二苯乙酰基甲烷(阿伏苯宗)，4-二甲氨基苯甲酸-2-异辛酯并显示出强烈的降解。第2个防晒油样品含有叔丁基甲氧基二苯乙酰基甲烷(阿伏苯宗)，4-甲基-苯亚甲基樟脑，2-苯基-5-苯并咪唑磺酸以及辛基三嗪酮，是一个稳定的配方。 2种防晒油样品薄层色谱UV检视和Vibrio fischeri检测的对比样品顺序：1.未辐照样品、2.人工光照样品、3.日光下皮肤涂布样品、4.日光辐照样品、5未光照样品。显示强烈的光降解的样品(上)和配方稳定样品(下) 为了比较HPTLC和HPLC方法以及鉴别降解产物，防晒霜提取物在HPTLC薄层板上展开后，将感兴趣的活性成分斑点从板上刮下并采用HPLC-DAD和LC-MS进行分析。该鉴别流程结果满意，由于HPTLC的塔板个数低于HPLC，因此薄层板上的某些个活性斑点在HPLC系统中被分开为几个色谱峰。生物发光检测下成分的峰高与传统检测方式 (HPTLC-UV， HPLC-DAD和LC-MS)下的响应不呈线性关系。甚至有一个高活性成分采用各种物理-化学方法都无法得到检测。 Vibrio fischeri生物活性检测可用于2个目的：： 一是它独特的选择性检测机制使其可以探测到过去无法发现的化合物。第二，细菌抑制作用作为一种活性指标可以帮助甄别出哪些光降解产物需要进行更进一步的毒理学评估。 AMAG CBS 中文版·第()·瑞士卡玛中国技术支持中心·info@camag-china.com