曲妥珠单抗中N-多糖检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-370 Excellence in ScienceLCMSMS-258 上海市淮海西路570号红坊E楼咨询电话：021-22013542http：//www.shimadzu.com.cn 基于 EreximTM技术对曲妥珠单抗的N-多糖微观异质性进行结构表征 LCMSMS-258 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用， 基于EreximTM(Energy-resolved oxonium ion monitoring)技术来对曲妥珠单抗进行多糖异质性的结构表征。结果表明：样品中糖链 ID43100 与和 ID44100结构与谱库中参比物的 ID43100 与和ID44100b 结构吻合，表明该曲妥珠单抗药物中含有糖链 ID43100 与和 ID44100b。可供相关研究者参考。 关键词： Erexim 曲妥珠单抗超高效液相色谱仪 三重四极杆质谱仪 糖链 蛋白质糖基化分为N-糖基化和O-糖基化两种类型。目前研究最多的是通过 N-糖苷键与多肽链中的天门冬酰胺链接的糖基化类型，即N-糖基化。对于单克隆抗体，在(Fc段)重链区，有一个共同的N-糖基化序列，N-糖基化修饰后的表达会影响这些单克隆抗体药效和安全性。因此有必要探讨 N-糖基化位点的多糖异质性。分析N-糖基通常首先从蛋白质上解离糖链，进而准确的定量与定性，但是得到的糖链是来自所有可能的糖蛋白和糖基化位点上糖链的平均结果；；但是，利用 EreximTM 作为分析辅助软件，可研究特定糖基化位点的多糖异质性等信息。 曲妥珠单抗是一种抗 Her2 的重组 DNA衍生的人源化单克隆抗体，它通过将自己附着在 Her2 上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，曲妥珠单抗还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。 本文以曲妥珠单抗为例，来展示如何基于EreximTM技术来对生物药物的多糖异质性进行定性结构表征，供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-30A(柱温箱)， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.82 色谱工作站，EreximTM 应用软件。 图1.EreximTM 应用软件 1.2分析条件 1.2.1分析测试流程 Step 2： Erexim Profile (定性分析) 1.2.2仪器条件 液相色谱条件 分析仪器： LC-30A系统 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为2%，时间程序见表1c 色谱柱： Phenomenex， Aeris Peptide XB-C18 表1梯度洗脱时间程序 2.1×150 mm 流动相：A-0.1%甲酸水溶液； B一乙腈/0.1%甲酸水溶液(90/10，v/v) 流速：0.3mL/min 进样体积：10 uL 柱：40℃ Time(min) Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 2 10.00 Pumps Pump B Conc. 30 11.00 Pumps Pump B Conc 98 12.00 Pumps Pump B Conc 98 12.10 Pumps Pump B Conc. 2 15.00 Controller Stop 质谱条件 脱溶剂管温度：250℃分析仪器： LCMS-8060加热模块温度：400℃离子子： ESI(+)扫描模式：多反应监测(MRM)雾化气：氮气3.0L/min驻留时间：10ms加热气：氮气10 L/min延迟时间：3ms干燥气：氮气10L/minQ1 Bias 和 Q3 Bias：同调谐文件碰撞气：氩气MRM 参数：：见表3、表4 接口温度：300℃ Step 1： 糖型定量 Dwell Time：8 ms. Paust Time： 2ms.表2部分糖型结构 Glycan ID Structure Glycan ID Structure Glycan ID Structure Glycan ID Structure Glycan ID| Structure 26000 44000 45110 818， 53000 54110 27000 44100 45020 ：81：.. 53100 55010 28000 m 45000 ：： 45120 ： 54000 55110 23100 45100 34000 54100 56000 33000 44010 om. 33100 55000 56100 43000 44110 34100 i. 00 55100 43100 45010 34110 54010 表3糖型定量的 MRM 参数(电荷为3) No. Glycan ID 前体离子 产物离子 CE(V) m/z(+3) m/z No. 产物离子 m/z Glycan ID CE(V) 1 23000 694.62 138.00 -27.7 28 54000 951.71 138.00 -60.6 2 25000 802.65 138.00 -41.6 29 54100 1000.40 138.00 -66.9 3 26000 856.67 138.00 -48.5 30 55000 1005.73 138.00 -67.6 4 27000 910.69 138.00 -55.4 31 55100 1054.42 138.00 -73.8 5 28000 964.70 138.00 -62.3 32 54010 1048.74 138.00 -73.1 6 29000 1018.72 138.00 -69.2 33 54110 1097.43 138.00 -79.3 7 2-10-000 1072.74 138.00 -76.1 34 55010 1102.76 138.00 -80.0 8 23100 743.30 138.00 -34.0 35 55110 1151.45 138.00 -86.2 9 33000 762.31 138.00 -36.4 36 55020 1199.79 138.00 -92.4 10 43000 830.00 138.00 -45.1 37 55120 1248.48 138.00 -98.6 11 43100 878.69 138.00 -51.3 38 44200Le 981.39 138.00 -64.4 12 44000 884.02 -52.0 39 45200Le 1035.41 138.00 -71.4 13 44100 932.70 -58.2 40 56000 1059.75 138.00 -74.5 14 45000 938.04 -58.9 41 56100 1108.43 138.00 -80.7 15 45100 986.72 138.00 -65.1 42 56010 1156.78 138.00 -86.9 16 44010 981.05 138.00 -64.4 43 56020 1253.81 138.00 -99.3 17 44110 1029.74 138.00 -70.6 44 56030 1350.84 138.00 -111.7 LCMSMS-258 18 45010 1035.07 138.00 -71.3 45 56110 1205.47 138.00 -93.1 19 45110 1083.75 138.00 -77.5 46 56120 1302.50 138.00 -105.6 20 45020 1132.10 138.00 -83.7 47 56130 1399.53 138.00 -118.0 21 45120 1180.79 138.00 -90.0 48 562130Le 1448.21 138.00 -124.2 22 34000 816.33 138.00 -43.3 49 56200Le 1157.12 138.00 -86.9 23 33100 810.99 138.00 -42.6 50 24000 748.63 138.00 -34.6 35100 919.03 138.00 -56.5 24 34100 865.01 138.00 -49.5 51 25 34110 962.04 138.00 -62.0 52 36100 973.05 138.00 -63.4 138.00 -65.8 26 53000 897.69 138.00 -53.7 53 992.05 27 53100 946.38 58100 1216.47 138.00 -94.5 Step 2： Erexim Profile 表4采集 Erexim Profile 的 MRM 参数 No. ( Glycan ID 前体离子 m/z 产物离子 m/z CE范围 Dwell Time Paust Time (+3) (V) (ms) (ms) 1 43100 878.69 138.00 -180~0 4 2 2 43100 878.69 147.07 -180~0 4 2 3 43100 878.69 163.06 -180~0 4 2 4 43100 878.69 204.09 -180~0 4 2 5 43100 878.69 366.14 -180~0 4 2 6 43100 878.69 528.19 -180~0 4 2 7 43100 878.69 690.25 -180~0 4 2 8 44100 932.70 138.00 -180~0 4 2 9 44100 932.70 147.07 -180~0 4 2 10 44100 932.70 163.06 -180~0 4 2 11 44100 932.70 204.09 -180~0 4 2 12 44100 932.70 366.14 -180~0 4 2 13 58100 1216.47 138.00 -180~0 4 2 14 58100 1216.47 147.07 -180~0 4 2 15 58100 1216.47 163.06 -180~0 4 2 16 58100 1216.47 204.09 -180~0 4 2 17 58100 1216.47 366.14 -180~0 4 2 18 58100 1216.47 528.19 -180~0 4 2 19 58100 1216.47 690.25 -180~0 4 2 1.3样品制备 1.3.1糖蛋白的溶液消化 向200 pL的PE管中，加入25 pL 100mM碳酸氢铵水溶液，再加入10pL水和5 pL 10 ug/uL单克隆抗体溶液。最后加入10 uL 500 ng/puL胰蛋白酶，充分混合，即得反应溶液。将反应溶液置于37℃热反应箱中反应2小时。反应后，在4℃的环境下保存。 1.3.2糖肽的选择性提取 在Supel-Select HLB SPE 30 mg/1 mL SPE软管中依次加入1 mL甲醇，1mL水，来清洗萃取 LCMSMS-258柱。然后用点样枪头在靠近SPE柱的固体层上方加入反应溶液，减压萃取，用1.5mL样品瓶收集从萃取柱中流出的溶液(注意：液体液面和固体层面平行即停)，然后在萃取柱中加入400 uL 0.1%甲酸和5%乙腈水溶液，合并流出液，用于LCMS分析。 结果讨论 2.1EreximTM原理 EreximTM是Energy-resolved oxionium ion monitoring的缩写。当使用串联质谱分析N-糖链和糖肽这类主体结构时，产物离子(氧鑰离子)会随着糖链结构的变化而不同。尤其是在三重四极杆串联质谱MRM分析方式下分析每种产物离子的时候，每个氧鑰离子的信号强度也随着碰撞能(以下用字母CE表述)的改变而不同。由碰撞能变化引起的氧鎓离子丰度比的趋势性变化轮廓图可以预测糖链间的结构差异。糖链中最典型的氧的离子是从N-糖链核心结构中得到的(m/z138)特异性离子。对N-糖链核心结构及糖链存在比例的分析可实现糖链间相对含量的测定。 图1EreximTM原理图 2.2糖型定量 2.2.1建立MRM 方法 使用MRM方法创建软件选择合适的糖链，软件自动生成目标糖肽列表。输入肽段的序列是EEQYNSTYR。将MS采集参数(驻留时间、延迟时间、CE、前体离子电荷(+3/+4))通过化合物列表转化成MRM通道信息。分析方法自动填入经过验证的CE数值。建立的信息保存在LabSolutions方法文件中，方法上传至LCMS-8060进行数据采集。 图2生成的糖链结构(左图)和验证后的CE 值(右图) 2.2.2采集的MRM色谱图 依据1.2.2的仪器条件采集的 MRM色谱图，如图3所示。 图3糖型定量的 MRM 图 2.2.3N-糖链比例图谱(氨基酸序列为EEQYNSTYR) 用LabSolutions软件进行峰积分，然后将数据导入Erexim数据处理软件，即可自动生成结合在IgGFc区域的N-糖链比例图谱(氨基酸序列为EEQYNSTYR)， 如图4所示。 图4N-糖链比例图谱(氨基酸序列为EEQYNSTYR) 表5N-糖链面积比例结果(以最大峰为100来表示) No. Glycan ID Area Area% No. Glycan ID Area Area% 1 43100 881012 100.00 21 23100 9930 1.13 2 44100 595022 67.54 22 45200Le 9653 1.10 3 33100 257751 29.26 23 28000 9015 1.02 4 34100 146120 16.59 8105 0.92 5 43000 135480 15.38 8025 0.91 6 24000 118814 13.49 54100 6407 0.73 7 53000 108635 12.33 5948 0.68 8 33000 89725 10.18 9.44 5804 0.66 9 45100 83131 4856 0.55 10 54000 74798 8.49 3892 0.44 11 44000 66105 7.50 31 3162 0.36 12 23000 43809 4.97 32 2717 0.31 13 25000 33839 3.84 33 2572 0.29 14 34000 32222 3.66 34 54110 2130 0.24 26814 3.04 35 2-10-000 1689 15 45010 0.19 16 53100 0.16 25112 2.85 36 55110 35100 0.16 13618 1.55 44110 953 0.11 13044 1.48 54010 655 0.07 11720 1.33 20 510 0.06 1.15 根据图4和表5所示，选择糖链ID 43100和44100为目标物用于Erexim数据采集。 2.3 Erexim Profile(定性分析) 2.3.1建立MRM方法 采用Erexim软件进行MRM方法创建，选择糖链结构ID43100和44100为目标物，前体离子选择是3电荷离子，产物离子选择m/z 138/163/204/147/366，碰撞能范围为-180~0V，以10V为间隔步进。建立的信息保存在LabSolutions方法文件中，方法上传至LCMS-8060进行数据采集。 图5生成Erexim的MRM方法截图 2.3.2采集的 MRM色谱图 依据1.2.2的仪器条件，采集 Glycan ID43100 和 44100 在不同 CE 能量下的 MRM图，如图6和图7所示。 图6 Glycan ID43100在不同CE能量下的MRM图 图7 Glycan ID44100在不同CE能量下的MRM图 2.3.3 Erexim profile (Erexim 趋势轮廓图) 在 LabSolutions 软件中进行峰积分，然后将数据保存并上传至 Erexim 软件进行数据处理，从而得到 Erexim 趋势轮廓图，并与 Erexim 谱库进行对比，如图8-11所示。 10e5- 138 147.0657 80e4- 163.0606 Esio 图9 Glycan ID43100 的 Erexim 趋势轮廓图与谱库对比结果 将样品的糖链 ID 43100 趋势轮廓图与 Erexim 谱库中参比趋势轮廓图比较，发现糖链 ID43100核心糖基 m/z138趋势轮廓图与参比谱图基本吻合， m/z 204(=GlcNAc N-乙酰葡萄糖胺)最佳 CID 能量(虚线表示)与参比谱图相同，说明在样品中糖链 ID 43100 结构与谱库中糖链ID 43100 有相同或类似糖链结构；但是该 CID 能量下的强度有差异，这说明样品糖链 ID 43100中还混有其他结构的糖链；当然这个强度差异也可能是较大糖链发生源内裂解引起的干扰问题。 图 10 Glycan ID44100 的 Erexim 趋势轮廓图 图11 Glycan ID44100 的 Erexim 趋势轮廓图与谱库对比结果 将样品中糖链 ID 44100 与 Erexim 谱库中2个参比数据文件比对 (44100a ER Ch3 和44100b ER Ch3)，同上分析，发现 m/z 204 (=GlcNAc) 跟 44100b ER Ch3 谱图更接近，说明在样品中糖链 ID 44100 结构与谱库中糖链 ID 44100b 有相同或类似糖链结构； 总之，通过将特定糖链的产物离子趋势轮廓图与 Erexim 数据库中的趋势轮廓图对比，从而 推断出单抗药物N-糖基化位点的糖基结构。 ■结论 使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用，结合 EreximTM技术建立一种对单抗药物的多聚糖异质性进行结构表征的新方法。并对曲妥珠单抗药物进行多聚糖异质性的结构表征。结果表明：通过糖型定量，测算出样品中糖链 ID43100 与和 ID44100相对含量较高；利用 EreximTM技术这两个糖链进行结构鉴定，其样品中两糖链结构与谱库参比物的结构吻合，表明该曲妥珠单抗药物中确实含有糖链 ID43100 与和 ID44100b。 一般N-糖链分析主要测试的是蛋白质水解后糖链；传统方法测试的糖链是来自所有可能的糖蛋白和糖基化位点上糖链的平均结果，而 EreximTM应用技术是分析糖基化位点上特定糖肽；并且该技术可以在没有标准物质的情况下测算每种糖链的结构和糖链间的相对含量；从而为研究者提供重要的单抗药物N-糖基化位点的相关信息。 田岛津全球应用技术开发支持中心 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用，结合EreximTM技术建立一种对单抗药物的多聚糖异质性进行结构表征的新方法。通过对曲妥珠单抗药物进行多聚糖异质性的结构表征，结果表明：通过糖型定量，测算出样品中糖链ID43100与和ID44100相对含量较高；利用EreximTM技术这两个糖链进行结构鉴定，其样品中两糖链结构与谱库参比物的结构吻合，表明该曲妥珠单抗药物中确实含有糖链ID43100与和ID44100b。