人血浆中贝伐单抗药含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-349 Excellence in ScienceLCMSMS-250 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn UHPLC-MS/MS 联用 Skyline 软件开展贝伐珠单抗定量方法开发 LCMSMS-250 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 与 Skyline软件联用建立贝伐珠单抗定量分析方法。通过 Skyline 软件完成 MRM 通道的设计和方法的输出， LabSolutions 基于 Skyline 导出的 MRM 分析方法，进行肽段筛选、碰撞能量优化，最终确认贝伐珠单抗的特征肽段及其对应的 MRM 离子对。基于以上所建立的方法，本文完成血浆中贝伐珠单抗药物的定量分析方法开发，定量特征肽段为 FTFSLDTSK(523.30>797.40)，线性范围为 0.146~300 ug/mL。 关键词： 三重四极杆质谱 Skyline 贝伐珠单抗定量分析 基于质谱法的蛋白定量在抗体药物临 床前及临床研究中受到越来越多的关注。为了使蛋白质定量技术在药物研究和临床检验更加紧密结合，岛津公司将其超快速液相色谱-质谱联用平台和强大的 Skyline定量蛋白质组学软件集成一体。根据蛋白质序列和用户自定义， Skyline 软件可以用来设计、改善以及优化多反应监测(MRM)，全扫描质谱和串联质谱定量法。Skyline 软件不仅将结果和方法优化结合起来，也为蛋白质定量的研究工作提供了标准化的工作流程。同时岛津研发工程师们为简化复杂生物基质中抗体药物的定量分析工作，对抗体药物前处理过程进行了独 特的设计，提出了 nSMOL 前处理试剂包，该方法能够有效富集血浆/血清中的抗体药物，实现Fab 区域的选择性酶解，提高酶解效率，极大降低了酶解产物的复杂性，对于复杂生物基质中抗体药物的准确定量提供了非常有利的工具。 本文基于岛津 LCMS-8060 液质联用系统，通过Skyline 设计，完成 MRM 通道的优化，完成抗体药物定量及定性肽段的初步筛选，进一步通过血浆样品的分析，筛选特异性的定量和定性肽段，完成LCMS方法结合 nSMOL 前处理技术定量分析血浆中贝伐珠单抗的方法开发工作。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8060三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.82 SP1色谱工作站， Skyline Ver.3.5.0.9319 软件。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱：： Waters BEH Peptide C18 2.0 mm I.D.x 150 mm L.， 1.7 um (方法开发)Inertsil Sustain Swift C18 Column (2.1 mm I.D.x50 mm L.，1.9 pm)(定量分析) 流动相：A 相-0.1%甲酸水溶液； B相-0.1%甲酸乙腈 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：10 uL 洗脱方式： 肽段筛选： 梯度洗脱，B相初始浓度为5%，洗脱程序 0.0-3.0 min， 5%；；.3.0-35.0 min， 5%~40%；35.0-37.5 min， 40%~95%；37.5~45.0min， 95%；45.5-50.0 min， 5%。 定量分析： 梯度洗脱，B相初始浓度为1%，流速0.4mL/min；洗脱程序 0.00-1.50 min， 1%；11.50-5.00min，1%~30%；5.02-5.83 min， 95%； 5.85~7.00 min， 1%； 0-5.01 min， 0.4mL/min； 5.03-6.20，1mL/min； 6.20-7.00 min， 0.4 mL/min 质谱条件 分析仪器： LCMS-8060干燥气： 氮气 5.0 L/min离子化模式： ESI(+)碰撞气： 氩气离子源接口电压：：1.0kV源温度： 300℃加热气： 空气15.0L/minDL温度： 250℃雾化气： 氮气 3.0L/min加热模块温度：400℃扫描模式： 多反应监测(MRM)延迟时间： 3ms 驻留时间： 17ms 定量分析MRM参数：见表1 1.3样品前处理过程 肽段筛选和 MRM 通道构建 10 ug/mL 贝伐珠单抗标准品，按照 nSMOL 试剂盒样品前处理过程进行贝伐珠单抗酶解，获得的酶解混合物直接上机分析。血浆中贝伐珠单抗的定量分析配制贝伐单抗血浆基质标准曲线：浓度分别为0.146、0.293、0.586、1.17、2.34、4.69、9.38、18.8、37.5、75、150、300 ug/mL， 按照 nSMOL 试剂盒进行样品前处理，获得的酶解昆合物直接上机分析。 表1MRM参数(贝伐珠单抗定量分析方法) 选择的肽段 区域 MRM 通通[m/z| Q1 Pre CE(V) Q3 Pre Bias (V) Bias (V) FTFSLDTSK 重链 CDR2 523.30([M+2H]2+)→797.40(y7*)* -38.0 -18.0 -34.0 523.30([M+2H]*)→898.50(y8*) -38.0 -20.0 -30.0 523.30([M+2H]2+)→650.30(y6*) -38.0 -19.0 -34.0 VLIYFTSSLHSGVPSR 轻链CDR2 588.30([M+3H]*)→775.90(y14**)* -22.0 -17.0 -28.0 588.30([M+3H])→939.50(y9*) -22.0 -27.0 -28.0 588.30([M+3H])→602.30(y6*) -22.0 -28.0 -22.0 STAYYLQMNSLR 重链 CH1 642.30([M+2H]")→861.50(y7*) -24.0 -25.0 -20.0 642.30([M+2H]2+)→748.40(y6*)* -24.0 -22.0 -28.0 642.30([M+2H]²)→620.30(y5*) 512.10([M+3H])292.30(b3+)* -24.0 -38.0 -24.0 -20.0 -32.0 -20.0 P14R (IS) 512.10([M+3H]+)→389.30(b4*) -38.0 -16.0 -28.0 512.10([M+3H])→660.40(b6*) -38.0 -17.0 -24.0 注：*表示定量离子 ■结果与讨论 2.1贝伐珠单抗特征肽段的筛选 图1利用 Skyline 导出的离子对列表信息构建 LC-MS/MS 肽段筛选方法 将数据库搜索获得的贝伐珠单抗 fasta 文件导入 Skyline 软件，构建合理的肽段设置和离子对设置的条件，根据设定导出贝伐珠单抗肽段的 MRM 方法， 在LabSolutions 软件中构建贝伐珠单抗肽段筛选的 LC-MS/MS方法，过程见图1，并且贝伐珠单抗酶解产物进行上机分析，分析结果见图2，所得结果导入 Skyline 软件，如图3所示。逐一查看检测出的 色谱峰，对未检出的肽段信息进行删除。所筛选出的肽段及 MRM 列表内容保存为新的Skyline 文件。 图2肽段筛选获得的MRM 色谱图 Skyline-Bevacizumab_Result Imput_01.sky * 图3筛选结果导入 Skyline 文件后的检出肽段确认 2.2碰撞能量优化 Skyline 软件采用“预定模式”“碰撞能量优化”导出 MRM 列表，基于筛选时采用的液相分离条件，同步对10个肽段 MRM 通道进行碰撞能量优化。LCMS-8060 能够实现Dwell time 最小 0.8 ms， Pause time 最小 1.0 ms 的设置，极大地提高了 MRM 通道的单次分析通量，因此可以实现贝伐珠单抗的10个肽段 MRM 通道碰撞能量同步进行优化。将LabSolutions 的分析结果导入Skyline 软件，对碰撞能量优化结果进行确认后见图4，碰撞能量优化过程重复1次，图中可见不同能量下所选择肽段的 MRM 通道面积变化重复性良好，最终根据两次分析的平均值导出含有最佳碰撞能量值的 MRM列表见表2。表2中所涉及到贝伐珠单抗相关肽段与 Fab 区域相关的特征肽段包括 STAYLQMNSLR、GPSVFPLAPSSK、FTFSLDTSK、VLIYFTSSLHSGVPSR； 与 Fc区域相关的特征肽段包括 ALPAPIEK、DTLMISR、DSTYSLSSTLTLSK、FNWYVDGVEVHNAK、 VVSVLTVLHQDWLNGK。本方法因为选择 nSMOL 前为前处理方法，该方法利用纳米颗粒表面固定化胰酶技术实现抗体药物 Fab 区域的选择性酶解，从而大大缩小了目标肽段的筛选范围。根据抗体药物的结构特点，绝大多数抗体药物的保守区域氨基酸序列差异较小，可变区域的氨基酸序列具有较大差异。在 LCMS定量分析目标蛋白方法开发的过程中，主要工作即是挑选出目标蛋白的特异性肽段。所以 nSMOL 前处理方法极大地降低了酶解产物的复杂性，在本实验中筛选阶段，共有9个肽段具有明显的色谱峰，其中4条肽段与贝伐珠单抗的 Fab 区域相关，而贝伐珠单抗具有代表性的特异性肽段集中于 Fab 区域。因此利用 nSMOL 前处理可以简化 LCMS 方法开发阶段的筛选过程，提高方法开发的速度。 表2 MRM参数 (Skyline 筛选肽段列表) 1/2 prot 1/9 pep 1/9 prec 1/28 tran 图4 Skyline 软件进行碰撞能量优化结果查看 2.4血浆中贝伐珠单抗定量分析结果 利用 Skyline 软件导出的含最佳碰撞能量的 MRM 列表，构建 LC-MS/MS 方法，根据 蛋白定量特特性原则进一步优化挑选出的肽段，最终选择 STAYYLQMNSLR、FTFSLDTSK、VLIYFTSSLHSGVPSR 作为特征肽段进行定量分析。血浆中贝伐珠单抗通过nSMOL试剂盒的选择性酶解，获得以上特征肽段，典型色谱图如图5所示。在 0.146~300ug/mL 范围内 STAYLQMNSLR 具有良好的线性关系，标准曲线见图6a；0.146~300 ug/mL范围内 FTFSLDTSK 具有良好的线性关系，标准曲线见图6b，并且该肽段的灵敏度显著高于 STAYLQMNSLR；由于肽段 VLIYFTSSLHSGVPSR 存在空白血浆基质中的干扰，所以在0.586~300 ug/mL 范围内 VLIYFTSSLHSGVPSR 具有良好的线性关系，标准曲线见图6c，标准曲线详细信息见表3。以上实验结果证明通过 Skyline 筛选出的特征肽段在生物基质中满足特异性要求，其中 FTFSLDTSK 灵敏度较高且选择性好，故可作为定量肽段；STAYLQMNSLR 和 VLIYFTSSLHSGVPSR 可作为定性肽段。 图5血浆中贝伐珠单抗 nSMOL 前处理后 LCMS分析获得的典型色谱图 Area Ratio Area Ratio Area Ratio 图6血浆中贝伐珠单抗检测标准曲线信息 表3标准曲线的线性方程和相关系数 抗体药物名称 肽段信息 校准曲线 线性范围(ug/mL) 相关系数r 准确度(%) 贝伐珠单抗 STAYLQMNSLR(定性) FTFSLDTSK(定量) VLIYFTSSLHSGVPSR (定性) Y=(0.0279439)X+(-0.000943832) Y=(0.0918856)X+(0.00746157) Y=(0.205532)X+(0.00952713) 0.146~300 0.9962 87.0~117.0 (-0.000943832) 0.146~300 0.9961 86.3~112.6 89.0~110.5 0.586~300 0.9970 结论 本文建立了一种使用岛津岛高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用并结合 Skyline 软件建立血浆中贝伐珠单抗定量分析的工作流程。结合 nSMOL 前处理技术，实现抗体药物 Fab 区域选择性酶解，从而显著降低了方法开发的复杂程度。在本实验中筛选阶段，共有9个肽段具有明显的色谱峰，其中4条肽段与贝伐珠单抗的 Fab区域相关，而贝伐珠单抗具有代表性的特异性肽段集中于 Fab 区域。实验通过 Skyline 软件完成MRM 通道的设计和方法的输出， LabSolutions 基于 Skyline 导出的 MRM 分析方法，进行肽段筛选、碰撞能量优化，最终确认贝伐珠单抗的特征肽段及其对应的 MRM 离子对。基于以上所建立的方法，本文完成血浆中贝伐珠单抗药物的定量分析方法开发，定量特征肽段为FTFSLDTSK (523.30>797.40)，线性范围为 0.146 ug/mL~300 ug/mL。 田岛津全球应用技术开发支持中心 本文基于岛津LCMS-8060液质联用系统，通过Skyline设计，完成MRM通道的优化，完成抗体药物定量及定性肽段的初步筛选，进一步通过血浆样品的分析，筛选特异性的定量和定性肽段，完成LCMS方法结合nSMOL前处理技术定量分析血浆中贝伐单抗的方法开发工作。