血浆中氨氯地平检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-294 LCMSMS-240 D岛津全球应用技术开发支持中心上海市淮海西路570号红坊E楼 咨询电话：021-22013542http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术测定人血浆中氨氯地平含量 LCMSMS-240 摘 要：本文建立与验证了使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定血浆中氨氯地平的方法。方法采用同位素内标法氨氯地平-D4定量，定量限0.03 ng/mL，线性范围为 0.03~100 ng/mL， 相关系数0.9995。方法选择性考察结果表明空白血浆中无明显干扰，日内精密度1.90~6.01%，日间精密度3.61~10.89%，各浓度水平质控样品的准确度87.3~109.7%，能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求；各浓度水平氨氯地平的回收率均在85%左右，基质效应大于82%；稳定性实验结果显示样品在室温下放置6小时稳定，3次冻融循环氨氯地平浓度无显著变化。实验样品分析结果表明，该方法具有分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，适合血浆中氨氯地平含量的快速准确检测，可用于人体内氨氯地平浓度的测定及其人体药代动力学研究，为指导临床氨氯地平浓度检测提供帮助。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱血浆氨氯地平 氨氯地平是一种硝苯地平类钙拮抗药，松弛在动脉壁的平滑肌，降低总外周阻力从而降低血压；在心绞痛时，氨氯地平增加血液流向心肌，对肾脏有一定的保护作用。临床上可治疗各种类型高血压(单独或与其他药物合并使用)和心绞痛，尤其自发性心绞痛(单独或与其他药 实验部分 1.1化合物信息 物合并使用)。 目前岛津推出灵敏度与仪器性能更加优越的 LCMS-8060，为展示岛津在DMPK领域技术水平与新型仪器的卓越性能，本实验使用 LCMS-8060 建立更为灵敏、高效的人血浆中氨氯地平含量的检测方法，供相关人员参考。 表1化合物信息 化合物名称 英文名 CAS No. 分子式 结构式 氨氯地平 Amlodipine 88150-42-9 C20H25ClN2O5 H3OC NH： 氨氯地平-D4 Amlodipine-D4 88150-42-9 C20H21D4ClN2O5 H3OC (IS) H3 NH 1.2仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2 输液泵， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.80 色谱工作站。 1.3分析条件 质谱条件 液相条件色谱柱： Shim-pack GISS C18(2.1 mmI.D.x50 mm L.，1.9 um)流动相：A相-2mM醋酸铵，0.1%甲酸水溶液；B相-乙腈流速：0.4mL/min柱温：40进样量：5uL洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%， 洗脱程序见表2。 分析仪器： LCMS-8060 离子化模式： ESI(+) 离子源接口电压： 0.5kV 雾化气： 氮气3.0L/min 加热气： 空气 10.0L/min 干燥气： 氮气 10.0 L/min 碰撞气： 氩气 接口温度： 300℃ DL 温度： 200℃ 加热模块温度：400℃ 表2梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 100 2.50 Pumps Pump B Conc. 100 2.60 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Controller Stop 扫描模式： 多反应监测(MRM) 驻留时间： 47 ms 延迟时间： 3 ms MRM参数：见表3 表3 MRM优化参数 化合物 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 氨氯地平 409.15 238.10* -47.0 -12.0 -13.0 294.10 -47.0 -15.0 -12.0 氨氯地平-D4 413.15 238.10* -47.0 -13.0 -12.0 注：*表示定量离子 1.4标准品与质控样品的配制 分别精密称取两份氨氯地平适量，用纯甲醇溶解配制两份 1.0 mg/mL 氨氯地平储备液。取其中一份储备液用50%甲醇溶液逐级稀释成浓度为1.5、5、15、50、150、500、1500、5000 ng/mL 的标准工作曲线；另一份储备液用50%甲醇溶液分别稀释成浓度为7.5、250、4000 ng/mL 的质控溶液。分别取标准工作曲线中各浓度点 20 uL加入980pL空白血浆中，依次衣制成标准曲线0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 ng/mL；分别取三个不同浓度质控溶液 20 uL加入980 uL空白血浆中，依次配制成0.15、5、80 ng/mL 质控样 精密称取氨氯地平-D4适量，用纯甲醇溶液溶解配制为1.0 mg/mL储备液。将配制好的氨氯地平-D4储备液用50%甲醇溶液稀释为 50 ng/mL 内标溶液。 1.5血浆样品前处理方法 取人血浆样品100pL，依次加入 50 ng/mL 内标溶液 20 uL、乙腈200uL， 呙旋混合2分钟，13000 rpm/min 离心10 min， 吸取上清液进样分析，进样体积5 uL。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 氨氯地平在一级质谱扫描下主要生成[M+H]+准分子离子峰 m/z 409.15， 对准分子离子峰进行产物离子扫描，生成主要碎片离子为 m/z 238.10、m/z294.10；氨氯地平-D4在一级质谱扫描下主要生成[M+H]*准分子离子峰 m/z 413.15，对准分子离子峰进行产物离子扫描，生成主要碎片离子为 m/z 238.10、m/z 298.10，其一级质谱图与产物离子扫描图分别见图1-4。 图1氨氯地平一级质谱图 图2氨氯地平产物离子扫描图(CE 值-13V) 图3氨氯地平-D44--级质谱图 图4氨氯地平-D4产物离子扫描图(CE值- 12V) 2.2方法选择性 取人空白血浆，按照1.5方法和选定的色谱条件处理并测定，得空白血浆、0.03 ng/mL血浆基质加标样品的 MRM色谱图，见图5。结果表明，氨氯地平与内标物的保留时间 tp分别为1.38 min 和 1.39 min。空白血浆中的内源物质干扰，对样品检测无明显影响，方法具有较强选择性。 6.26e3 Q413.15>238.10 1.23e6 C D 图5氨氯地平与氨氯地平-D4 MRM 色谱图 (A、B：空白血浆； C： 0.03 ng/mL 氨氯地平血浆基质加标； LCMSMS-240D： 50 ng/mL 氨氯地平-D4血浆基质加标) 2.3线性范围与灵敏度 按照1.4项下血浆样品配制方法制备0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 ng/mL 血浆标准工作曲线，按照1.5项中血浆样品前处理方法处理血浆样品，建立标准曲线，并用同位素内标法进行分析测定。以血浆中氨氯地平浓度与内标浓度(以1计)的比值X为横坐标，以氨氯地平峰面积与氨氯地平-D4峰面积的比值Y为纵坐标，权重系数为1/C， 进行线性回归分析，所得标准曲线见图6，血浆中氨氯地平线性回归方程及相关系数见表4。结果表明氨氯地平在 0.03-100 ng/mL 的浓度范围内线性关系良好。 在本实验所建立的方法中，氨氯地平最低定量限为 0.03 ng/mL，平行制备6份最低定量限浓度的血浆样品，其 RSD 为5.04%(n=6)，准确度为91.4-102.1%， S/N 平均值为30.8。结果表明，此浓度水平精密度为与准确度均在接受标准内，并已满足临床检测浓度A要rea Ratio(x10)求。 图6氨氯地平标准曲线 表4氨氯地平标准曲线参数(线性回归，权重系数为Y=1/C) 化合物 校准曲线 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 氨氯地平 Y=(0.0964555)X +(0.00144539) 0.03-100 97.3~105.3 0.9995 表5标准曲线各浓度点准确度 级别 标准浓度(ng/mL) 实测浓度(ng/mL) 准确度(%) 0.03 0.030 98.6 2 0.1 0.105 105.3 0.3 0.298 99.4 4 0.973 97.3 5 2.899 96.6 6 10 9.972 99.7 30 30.450 101.5 100 101.519 101.5 图7LCMS-8060 0.03 ng/mLMRM色谱图 图8LCMS-8045 0.03 ng/mLMRM色谱图 2.4方法精密度与准确度 取已配制好的0.15、5、80 ng/mL 质控样品，按照1.5方法制备，每个浓度的质控血浆样品在 1 day 内制备6份平行样品分析，连续测定 3 day， 每日随行标准曲线，用测得质控样品中氨氯地平峰面积的 RSD%值计算其日间和日内差异，结果见表5. 表6氨氯地平日内精密度与日间将密度(3天，每天n=6) 理论浓度 日内精密度 RSD% 日间精密度RSD% 准确度% (ng/mL) 0.15 6.01 10.89 87.3~109.7 5 1.90 5.04 98.4~105.7 80 2.71 3.61 97.3~107.3 2.5回收率 取浓度为0.15、5、80 ng/mL质控样品(每个浓度重复6次)，按照1.5方法制备，以血浆样本制备进样检测后色谱峰面积(A1)与空白血浆按照1.5方法处理后加入标准品溶液进样检测所得色谱峰面积(A2)之比，即 A1/A2×100%，考察血浆样本处理方法去提取回收率。实验结果见表6，各浓度水平氨氯地平回收率均大于85%。 表7方法回收率结果(n=6) 浓度水平 理论浓度 平均回收率% (ng/mL) LQC 0.15 85.0 MQC 5 87.3 2.6基质效应 考察低、中、高三浓度水平质控样品(每个浓度重复6次)，通过比较空白血浆后加标样品与浓度一致的标准溶液，两者的目标化合物面积平均值所得比值即为基质效应。结果见表7，彳各浓度水平基质效应因子均大于80%。 表8基质效应考察结果(n=6) 浓度水平 理论浓度 基质效应% (ng/mL) LQC 0.15 89.2 MQC 5 82.4 HQC 80 82.6 2.7稳定性试验 为评价生物样品在周围环境(如室温、光照)7下的稳定性，将低、中、高三浓度水平质控样品(n=5)在室温桌面放置6h以上，按照1.5方法制备并进行测定，将测定值浓度与理论值进行比较。结果显示，三个浓度水平的质控样品测定值与理论值的差异均在15%以内，并且CV%值均小于6%。血浆中氨氯地平在室温下6小时具有稳定性。 考察生物样品在处理、制备等过程中反复冻融的稳定性，将高、中、低质控样品(n=6)反复冻融三个周期，每一周期大于12h，经制备后同法测定，，与理论值进行比较。结果显示，测定值与理论值的差异均在±15%以内，并且CV%值均小于10%。说明血浆中氨氯地平的浓度在3次冻融循环的过程中不会发生显著的改变。 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用测定血浆中氨氯地平的方法。该方法在4 min 内完成血浆中氨氯地平的检测，采用同位素内标法定量，方法定量限 0.03 ng/mL， 线性范围为0.03~100 ng/mL， 相关系数在0.9995。选择性考察结果表明空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质，并且氨氯地平和其同位素内标之间无相互干扰。方法的日内精密度1.90~6.01%，日间精密度3.61~10.89%，各浓度水平质控样品的准确度87.3~109.7%，能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求；各浓度水平氨氯地平的回收率均在85%左右，基质效应大于82%；稳定性实验结果表明样品在室温下放置6小时稳定，3次冻融循环氨氯地平浓度无显著变化。方法具有分析方法简单、分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，满足氨氯地平体内药物分析要求，适合血浆中氨氯地平含量的快速准确检测。 该解决方案建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定血浆中氨氯地平的方法。该方法在4 min内完成血浆中氨氯地平的检测，采用同位素内标法定量，方法定量限0.03 ng/mL，线性范围为0.03~100 ng/mL，相关系数在0.9995。选择性考察结果表明空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质，并且氨氯地平和其同位素内标之间无相互干扰。方法的日内精密度1.90~6.01%，日间精密度3.61~10.89%，各浓度水平质控样品的准确度87.3~109.7%，能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求；各浓度水平氨氯地平的回收率均在85%左右，基质效应大于82%；稳定性实验结果表明样品在室温下放置6小时稳定，3次冻融循环氨氯地平浓度无显著变化。方法具有分析方法简单、分析速度快、灵敏度高、重现性好的特点，满足氨氯地平体内药物分析要求，适合血浆中氨氯地平含量的快速准确检测。