小鼠抗体中氨基酸序列分析检测方案(生物质谱)

LAAN-A-BI002 Applicationn NNo.B63News用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2017年4月400-650-0439 I序言 在制药领域中，最近经常会听到一个词语-——“生物药品”。另一种说法是生物技术药物，均是指利用基因重组、细胞融合、细胞培养等生物科技研发生产的蛋白药物、抗体药物等。相对于此，传统的药物被称为“小分子药物”，通过化学合成。两者均属于化合物，但与通过化学合成的低分子药物相比，生物技术药物具有更大分子量的特征。2015年，全世界药品销量前10的药剂中，有7种都是生物技术药物。 生物技术药物因疗效佳、不良反应少、适用疾病范围广等优点而备受期待。但非常遗憾，与目前主流的小分子药物不同，生物技术药物无法像化学合成品那样进行大量生产。生物技术的生产包含制造、精制、剂型设计、储存等多项工艺。为保证生物技术药物的质量，不仅要进行与产品有关的质量试验，还必须考虑由原材料和制造工艺带来的影响。因此，在药物的制造和质量管理过程中，要求采取不同于化学合成的小分子药物的措施。当前，生物技术药物已具有评估其质量专用的指南。该指南要求进行特性分析，而特性分析的其中一种方法为N末端氨基酸序列分析。该分析旨在对根据基因序列推测的N末端氨基酸序列与制造的生物药品的N 末端氨基酸序列进行比较和确认。分析方法采用埃德曼降解法。该分析方法是从蛋白质的N末端侧依次切断氨基酸，由此来测定氨基酸序列的方法，能得到可靠性较高的氨基酸序列结果。而使该方法自动化的系统便是蛋白质测序仪PPSQ-51A/53A。该设备能简单的鉴定来自目标蛋白质和肽的N 末端的氨基酸序列。 在此，作为生物药品的N末端氨基酸序列分析的实例，这里介绍使用蛋白质测序仪 PPSQ-50A 系列分析小鼠抗体IgG的氨基酸序列分析。 T. Kuriki 方法 抗体的基本结构由2条H链(也称为重链、分子量较大)和2条L链(也称为轻链，分子量较小)组成。 由于完整抗体的分子量较大(约150kDa)，很难直接通过蛋白质测序仪进行N末端氨基酸序列分析。该分析例使用了 SDS-PAGE ( Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamydeGel Electrophoresis )，对小鼠单克隆抗体 IgG 20 pmol 的H链和L链分别进行了分离，然后采用电印迹法将其转印到了PVDF膜上。采用 PPSQ-53A分别对经CBB 染色的L链、H链的PVDF 膜进行了分析。 图1N末端氨基酸序列分析的方案 图2电印迹转转后的 PVDF膜 N末端氨基酸序列分析结果 图3和图4分别为小鼠单克隆抗体IgG的L链、H链的N末端氨基酸序列分析结果。分别显示了样本从第1至第5循环的色谱图(第1循环为原始色谱图、从第2循环开始为差减色谱图)。如图3所示，根据L链的第1循环结果，鉴定N末端的氨基酸残基为天冬氨酸(Asp)，根据第2个循环的结果，鉴定N末端的第2个氨基酸残基为异亮氨酸(Ile)。共对 20个残基进行了分析，结果鉴定了其从N末端侧开始的序列为Asp-Ile-GIn-Met-Thr-GIn-Ser-Pro-Ser-Thr-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr，通过数据库检索，确认为 kappa 轻链IgG1。 与之相同，H链的第5循环之前的结果如图4所示。推测其从N末端侧开始的序列为 Glu-Val-GIn-Leu-GIn-Glu-Ser-Gly-Pro-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly，通过数据库检索，确认为抗体重链。像这样通过蛋白质测序仪进行分析，能简单且正确的鉴定N末端的氨基酸序列，蛋白质测序仪可谓是对生物技术药物质量管理十分有用的系统。 图3L链色谱图(1~5循环) mAU DPTU DPU 图4H链色谱图(1~5循环) ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售；*本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。 ) 当前，生物技术药物已具有评估其质量专用的指南。该指南要求进行特性分析，而特性分析的其中一种方法为N末端氨基酸序列分析。该分析旨在对根据基因序列推测的N末端氨基酸序列与制造的生物药品的N末端氨基酸序列进行比较和确认。分析方法采用埃德曼降解法。该分析方法是从蛋白质的N末端侧依次切断氨基酸，由此来测定氨基酸序列的方法，能得到可靠性较高的氨基酸序列结果。而使该方法自动化的系统便是蛋白质测序仪PPSQ-51A/53A。该设备能简单的鉴定来自目标蛋白质和肽的N末端的氨基酸序列。