对两种市售龟甲胶药材样品中特征多肽检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-200作者：徐明，张品沈阳分析中心Email： shexm@shimadzu.com.cn，shezp@shimadzu.com.cn 岛津应用数据集色谱分析 LCMSMS-210 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用定性分析龟甲胶药材 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8040联用定性分析龟甲胶的方法。本文文照《中国药典(2015版)》中龟甲胶项下，使用胰蛋白酶酶解龟甲胶样品，选择龟甲胶的特征肽段作为定性依据。龟甲胶对照药材和市售药材样品特征肽段对应的两对特征离子满足药典中要求的 MRM 色谱峰中信噪比大于 3：1的规定，表明方法及系统可用于特征肽段的检测。本方法能够完全满足药典的要求，实现龟甲胶药材的快速、准确、灵敏的定性分析。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱龟甲胶定性分析特征肽段 胶类药材是具有典型民族特色的传统中药，为动物的皮熬制而成的明胶类物质，以补血、升血功能而著称。在2010版中国药典中通过茚三酮显色法进行定性鉴别，此方法缺少特异性，不易对不同来源的胶类药材进行区分。2015版药典对鉴定方法进行修正，把原来的茚三酮显色法改为液质联用的方法检测特征性肽段，方法更科学可靠。该方法使用胰蛋白酶对不同来源的明胶类物质进行酶切处理，通过液质联用技术发现不同样品胶的酶解产物存在特征肽段的差异。从而通过检测样品胶中的特征肽段对样品 胶的种类进行鉴定。2015版中国药典收录阿胶、鹿角胶和龟甲胶三种胶类药材采用液质联用检测特征肽段的定性方法，为此类药材的质量控制提供更加可靠和准确的分析依据。 本文利用岛津三重四极杆液质联用系统LCMS-8040 对龟甲胶中的特征肽段进行分析，依据2015版中国药典建立了龟甲胶定性鉴别的分析方法，可为该类样品的分析提供参考。 1.实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用系统。具体配置为LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5 在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱，CBM-20A 系统控制器， LCMS-8040三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.60SP2 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack XR-ODS II22.0mmI.D.x100 mm L.， 2.2 pm 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液柱温：35℃B相-乙腈进样量：5uL 流速：0.3mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，洗脱程序见表1. 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 5 25.00 Pumps Pump B Conc. 20 40.00 Pumps Pump B Conc. 50 41.00 Pumps Pump B Conc. 99 45.00 Pumps Pump B Conc. 99 45.01 Pumps Pump B Conc. 5 55.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI，正离子模式DL温度：250℃离子喷雾电压： +4.5 kV加热模块温度：400℃雾化气流速：束气 3.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气流速：氮气15 L/min驻留时间：100ms碰撞气：氩气延迟时间：3ms MRM参数：见表2 表2MRM优化参数 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q1 Pre Bias (V) 龟甲胶特征肽段 631.40 546.20 -32 -22 -38 921.40 -32 -35 -40 1.3对照品和样品配制及前处理方法 取对照药材或待测样品粉末0.1g，加入1%碳酸氢铵溶液 50mL， 超声处理 30 min，用微孔滤膜滤过。参照《中国药典(2015版)》龟甲胶项下，取滤液100 uL， 置于进样瓶中，加入胰蛋白酶溶液 10pL(用1%碳酸氢铵溶液配制成浓度为 1 mg/mL 的胰酶溶液)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为对照药材溶液或供试液。 2.结果与讨论 2.1龟甲胶对照药材的 MRM色谱图 图1龟甲胶对照药材特征多肽的 MRM色谱图 LCMS 分析获得龟甲胶对照药材特征多肽的 MRM 色谱图，保留时间10.85 min， 图1中两对特征离子对631.40>546.20以及631.40>921.40的信噪比分别为127479和7451，充分满足药典中要求的色谱峰信噪比大于 3：1的要求。 2.2实际样品分析 对两种市售龟甲胶药材样品进行分析，结果如图2、3和表3所示。 图2样品1的MRM色谱图 (x100，000) 图3样品2的MRM色谱图 表3实际样品中龟甲胶定性分析结果 样品编号 离子对信息 保留时间(min) 峰高 峰面积 S/N 样品1 631.40>546.20 10.92 444872 8394157 107410 631.40>921.40 6445 124599 6632 样品2 631.40>546.20 10.89 131518 2454106 38049 631.40>921.40 1998 35815 1238 3.结论 本文建立了一种使用岛津三重四重杆液质联用仪LCMS-8040 测定龟甲胶中特征肽段， 实现龟甲胶定性分析的方法。该方法所检测的龟甲胶特征肽段 MRM 色谱图中两对离子对631.40>546.20，631.40>921.40的响应明显，完全满足2015版药典信噪比大于3：1的要求，市售龟甲胶药材样品分析结果表明所测2个样品中均含有龟甲胶成份。因此，本方法可为应对药典要求实现龟甲胶药材的快速、准确、灵敏的定性鉴别提供参考。 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用定性分析龟甲胶的方法。本文参照《中国药典（2015 版）》中龟甲胶项下，使用胰蛋白酶酶解龟甲胶样品，选择龟甲胶的特征肽段作为定性依据。龟甲胶对照药材和市售药材样品特征肽段对应的两对特征离子满足药典中要求的MRM 色谱峰中信噪比大于3:1的规定，表明方法及系统可用于特征肽段的检测。本方法能够完全满足药典的要求，实现龟甲胶药材的快速、准确、灵敏的定性分析。