胶类药材中鉴别检测方案(液相色谱仪)

实验部分 采用安捷伦液质联用技术对胶类药材进行鉴定 应用简报制药行业 作者 摘要 ( 胡楠左帅杜伟薄涛安捷伦科技(中国)有限公司 ) 本文基于2015年版《中国药典》”中采用液质联用技术分析胶类药材的定性方法，开发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用 (LC/QQQ) 法和四极杆飞行时间液质联用(LC/Q-TOF)法进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别；同时，利用 Q-TOF 强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，建立了特征肽段序列分析方法以及“假药”的初步定性方法。 前言 胶类药材是我国传统中药中一类特殊的动物药，是由动物的皮、骨骼等经特殊工艺加工而成，常见的有阿胶、鹿角胶、龟甲胶及其相关中成药制剂。近年来，随着胶类药用量增长，原料资源供不应求，新闻曝光了一些不法生产企业为降低成本，采用其它动物杂皮投料，给消费者的健康带来严重隐患。为了保障公众用药安全有效，2015年版《中国药典》制订了符合胶类药材特点的定性方法：采用液质联用技术，分析阿胶、鹿角胶、龟甲胶的特征肽段，方法专属性强、科学可靠。 安捷伦科技公司针对这一变化开发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用 (LC/QQQ)法，进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别。同时，鉴于很多实验室有高分辨质谱测试需求， 我们在药典 LC-QQQ 方法的基础上，开发了四极杆飞行时间液质联用 (LC/Q-TOF)法。此外，利用 Q-TOF 强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，建立了特征肽段序列分析方法以及“假药”的初步定性方法。 试剂和样品材料 实验用色谱纯乙腈购自 Merck， 色谱纯甲酸购自 Dikma，超纯水为 Milli-Q系统制备，碳酸氢铵购自 ACROS， 胰蛋白酶购自Promega。样品材料为市售阿胶、鹿角胶、龟甲胶。 仪器 Agilent 1290 Infinity lI 超高效液相色谱 Agilent 6460C 三重四极杆质谱仪 Agilent 6530 四极杆飞行时间质谱仪 样品制备 取样品粉末0.01g， 加1%碳酸氢铵溶液5 mL， 超声处理30分钟后，用0.22 uM 微孔滤膜过滤，取续滤液100 pL置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液 10 pL(采用序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1 mg胰蛋白酶的溶液，临用时配时)，摇匀，37℃恒温酶解12小时。 色谱柱： Eclipse Plus C18(2.1x100mm， 1.8 um) 柱温： 40°C 进样体积： 5pL 流速： 0.3mL/min 流动： A：H，0含0.1%甲酸；B：乙腈 梯度洗脱： 0 min 5%B； 25 min 20%B； 40 min 50%B 三重四极杆串联质谱条件 质谱系统： Agilent 6460C 离子源： 配备安捷伦喷射流的 ESI 模式： 正离子 雾化气： N， 雾化气压力： 30.0 psi 干燥气温度： 325°C 干燥气流量： 8.0 L/min 毛细管电压： 3500V 鞘气温度： 350 °C 鞘气流量： 12.0 L/min 喷嘴电压： 0V Delta EMV： 0V 扫描模式： MRM 表1中列出了与待测物相关的 MS MRM 参数 化合物名 母离子 MS1 分辨率 子离子 MS2分辨率 驻留时间 碎裂电压(V) 碰撞能量(eV) 阿胶 539.8 Unit 612.4 Unit 100 120 20 阿胶 539.8 Unit 923.8 Unit 100 120 20 鹿角胶 765.4 Unit 733.0 Unit 100 135 15 鹿角胶 765.4 Unit 554.0 Unit 100 135 20 龟甲胶 631.3 Unit 921.4 Unit 100 120 30 龟甲胶 631.3 Unit 546.4 Unit 100 120 18 四极杆飞行时间质谱条件 表2.四极杆飞行时间质谱目标质量数列表 质谱系统： Agilent 6530 离子源： 配备安捷伦喷射流的 ESI 模式： 正离子 雾化气： N2 雾化气压力： 30.0 psi 干燥气温度： 325 °C 化合物名 质量 价态 窗口宽度 碰撞能量 (eV) 阿胶 539.7862 2 Medium 20 鹿角胶 765.7108 2 Medium 15 鹿角胶 765.7108 2 Medium 20 龟甲胶 631.3355 2 Medium 30 龟甲胶 631.3355 2 Medium 18 干燥气流量： 8.0L/min 毛细管电压： 3500 V 鞘气温度： 350°C 鞘气流量： 12.0L/min 喷嘴电压： 0V 扫描速度： 3谱图/秒 扫描模式： 鉴定采用 Target MS/MS， 未知肽段定性采用 Auto MS/MS 表2中列出了与待测物相关的目标质量数 结果与讨论 基于2015年版《中国药典》开发的 LC/QQQ法分析胶类药材，重现性好、灵敏度高。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各 MRM通道信噪比均大于500， 其中龟甲胶的631.3→546.4通道信噪比大于77000(如图1所示)，完全能够满足2015年版《中国药典》信噪比大于 3：1 的要求。 图 1.采用 LC/QQQ 法分析龟甲胶所得 TIC 及 MRM 色谱图， 其中631.3→546.4通道信噪比大于77000， 从上到下依次为： TIC色谱图，通道631.3→546.4和631.3→921.4的 MRM 色谱图 采用 LC/Q-TOF 法分析胶类药物时，利用 Target MS/MS模式采集数据，运用高分辨 EIC 碎片离子提取技术进行数据处理，可以获得与LC/QQQ法一致的定性结果。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各特征离子信噪比均大于200，同样完全满足2015年版《中国药典》信噪比大于 3：1的要求。图2为采用 LC/Q-TOF 法分析龟甲胶所得特征碎片离子色谱图。 图2.采用LC/Q-TOF法分析龟甲胶所得高分辨特征碎片离子色谱图，其中631.3→546.4通道信噪比大于44000，从上到下依次为：两个特征离子提取色谱图，通道 631.3355→546.2769和631.3355→921.4776的提取离子流图，提取离子窗口宽度 50 ppm 除了药典规定的离子对外，还可结合文献报道2.31的特征肽段，采用 QQQ SIM 模式或 Q-TOF 提取离子模式进行胶类样品的专属性鉴别，杜绝掺假样品。图3为阿胶特征谱图。 图3.阿胶特征谱图： 1.m/z 469.2； 2. m/z 618.8； 3.m/z 539.8； 4.m/z 765.9 此外， Q-TOF可以提供可靠的 MS 和 MS/MS数据，其具有强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，可以进行特征肽段的序列分析。图4和图5展示了阿胶中上述特征肽段 m/z 618.3二级质谱图及其序列分析结果。该特征肽段位于驴的Ⅰ型胶原蛋白a2 链上第692-706位置上，氨基酸序列为 G-E-A-G-A-A-G-P-A-G-P-A-G-P-R。 图4.阿胶中特征肽段 m/z 618.3的二级质谱图 图5.阿胶中特征肽段 m/z 618.3的序列分析结果 此种高分辨二级质谱结合蛋白质库的 Q-TOF分析方法也可扩展到“假胶类药材”分析上。检测时发现一市售龟甲胶未检测出特征离子(图6)， 于是对其进行 Auto MS/MS模式分析，经蛋白质库检索发现多段属于牛皮胶原蛋白的特异性肽段(图7)，推测这分龟甲胶可能是用牛皮或相关产品仿冒的。通过此方法可有效的对“假胶类药材”进行初步定性分析，为打假工作提供了有效依据。 X107 +ESI TIC MS(所有)Frag=175.0V Guijia-user.d 图6.某市售龟甲胶未检出龟甲胶特征定性离子，从上到下依次为： MS总离子流图、通道631.3→546.4和631.3→921.4的提取离子流图 响应 vs. 采集时间(min) 图7.某市售龟甲胶中发现的牛皮皮原蛋白特异性肽段，从上到下依次为：牛皮胶Ⅰ型胶原蛋白a1链上第781-795氨基酸序列、a2链上第950-607氨基酸序列、a2链上第1066-1078氨基酸序列 结论 分别采用 Agilent 6400 系列 QQQ 和6500系列Q-TOF 液质联用系统，针对2015版药典收载的阿胶、龟甲胶、鹿角胶三种胶类药材进行定性方法开发，结果表明，阿胶、龟甲胶、鹿角胶的信噪比远远优于药典的要求。在此基础上，开发了胶类药品的专属性肽段鉴别方法以及特征肽段序列分析方法，并将特征肽段分析成功应用于一例“假龟甲胶”的鉴别中。 ( 参考文献 ) ( [1]《中国药典》2015年版第一部 ) ( [2]《胶类药材质量控制关键技术研究》北京中医药大学博士论文，作者：程显隆 ) ( [3] X ian-Long Cheng et.al. Identification of five gelatins byultra performance l iquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry ( U PLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 6 2 ( 2012) 191-195 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn 安捷伦科技大学： http：//www.lsca-china.com.cn/agilent 浏览和订阅 Access Agilent 电子期刊： www.agilent.com/chem/accessagilent-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2015 2015年8月21日，中国印刷 5991-6178CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 分别采用 Agilent 6400 系列 QQQ 和 6500 系列 Q-TOF 液质联用系统，针对 2015 版药典收载的阿胶、龟甲胶、鹿角胶三种胶类药材进行定性方法开发，结果表明，阿胶、龟甲胶、鹿角胶的信噪比远远优于药典的要求。在此基础上，开发了胶类药品的专属性肽段鉴别方法以及特征肽段序列分析方法，并将特征肽段分析成功应用于一例“假龟甲胶”的鉴别中。