半胱氨酸中抗体药物偶联物及其药物/抗体比率检测方案(液质联用仪)

采用天然质谱法对半胱氨酸连接的抗体药物偶联物及其药物/抗体比率进行测定 应用简报生物制药 作者左帅 摘要 安捷伦科技(中国)有限公司 本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate， ADC) 为研究对象，使用天然质谱法， 通过 Agilent 6530 Q-TOF LC/MS 检测 ADC 的完整分子量，并使用安捷伦 DAR 计算器软件 (Agilent DAR Calculator) 计算 ADC 的加权平均药物/抗体比率(Drug to Antibody Ratio， DAR)。 前言 抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate， ADC) 是一类通过特定连接物将细胞毒性药物与单克隆抗体共价连接的大分子药物，是下一代抗癌药中最有前景的抗体类药物，其分析表征是生物制药研发的重要基础。药物/抗体比率 (Drug-to-Antibody Ratio， DAR)是抗体所连接药物数量的平均值，是衡量 ADC 质量的关键属性。低的 DAR 值可能会导致疗效的下降，而较高的 DAR 值又可能会影响 ADC 的安全性，因此对 ADC DAR 的检测至关重要。 天然质谱法/非变性质谱法 (Native Mass Spectrometry) 是一种既能保留蛋白在溶液中的天然或接近天然的结构，又能满足质谱检测条件的蛋白质质谱分析方法。现今，天然质谱法作为表征非共价结合的完整蛋白复合物的重要技术手段，已越来越多的受到关注。 本文以半胱氨酸连接的ADC 为研究对象，使用天然质谱法测定了半胱氨酸连接的 ADC的完整分子量。并基于质谱结果，使用安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DAR Calculator) 计算出 ADC 的加权平均 DAR. 试剂和样品 维布妥昔单抗为半胱氨酸连接的抗体药物偶联物； PNGaseF 购自New England Biolabs； 乙酸铵购自 DikmaPure。 仪器 实验在 Agilent UHPLC/Q-TOF系统上进行，包括 Agilent 1290Infinity II 液相色谱系统和高分辨率 Agilent 6530精确质量四极杆飞行时间 (ESI+)液质联用系统。 样品制备 取 100 ug ADC样品， 加入1 pL PNGaseF， 37°℃酶解4h以上。 液相色谱条件 色谱沐： polyhydroxyethyl-A (PHEA) (PolyLC，Columbia，MD)， 2.1×200 mm， 5 pm， 300 A流动相： 200mM 乙酸铵， pH=7.0流速： 30 pL/min梯度： 等度 温度： 23°C 质谱条件 雾化器： 微升雾化器 (micro nebulizer) 干燥气温度： 325°C 干燥气流速： 8 L/min 雾化气压力： 20 psi 毛细管电压： 5000V 碎裂电压： 420 V 一级质谱扫描速率： 1spec/s 一级质谱质量数范围： 1000 m/z-8000 m/z 维布妥昔单抗是一类半胱氨酸连接的抗体药物偶联物，其形成过程为：偶联前对抗体的链间二硫键进行部分还原形成半胱氨酸残基，半胱氨酸残基再与小分子药物连接形成了一种载药量为0-8个药物的混合物，如图12所示。由此可见此类 ADC 中抗体的轻链和重链是通过共价键和非共价键连接复合而成的。传统的液质联用方法由于使用了乙腈等有机试剂，会破坏此类 ADC药物中的非共价键连接， 导致 ADC 结构的不完整；而能够保留其结构完整性的常规方法，如疏水相互作用色谱法 (HydrophobicInteraction Chromatography， HIC)， 由于使用了非挥发性的高浓度盐，无法与质谱兼容，因而无法直接使用质谱进行 ADC 的定性。 mAb Drug 图1.半胱氨酸连接的抗体药物偶联物示意图 本文采用体积排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography， SEC)，使用质谱兼容的挥发性盐溶液，用天然质谱法 (Native MassSpectrometry) 检测了 ADC 的完整分子量。图2展示了使用天然质谱法检测去糖 ADC 裸抗的结果。天然质谱法由于使用了温和的色谱质谱条件，抗体结构并未完全伸展，分子带电荷数少于反相条件的质谱检测结果，因此所带质荷比更高。 计数与解卷积质量 (amu) 图2.使用非变性条件的天然质谱法检测去糖 ADC 裸抗所得的质谱图 (a) 与解卷积结果(b) 图3展示了使用非变性条件的天然质谱法检测去糖ADC 的结果。在图 3a 中括号标记的部分，经解卷积解析是连接了化学单元的轻链 (LC-linker) 和连接了一个小分子药物的轻链(LC-1d) (图3c)。可以看出在非变性条件下检测 ADC， 大部分分子都保持了原有的完整结构(图3b)，检测到的部分碎片 (LC-linker， LC-1d) 有可能是由于源内裂解导致的。 图3.使用非变性条件的天然质谱法检测去糖 ADC 所得的质谱图(a)、完整 ADC 解卷积结果(b)和片段解卷积结果 (c) 将天然质谱法检测得到的去糖完整 ADC 解卷积结果导入到安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DAR Calculator)中，可以直接对 ADC 的 DAR 进行计算。图4展示的是使用安捷伦 DAR 计算器计算 ADC 的 DAR 的结果。如图4所示，将去糖完整 ADC 的质谱解卷积结果导入 DAR 计算器，在确定了‘DARO'和‘Drug/Linker’的值后，软件能够自动识别DAR 2- DAR 8的峰， 并计算出该ADC 的 DAR 值为 4.3，这个 DAR 值是通过各峰的峰面积计算的。软件同样支持使用峰高计算 DAR 值，如图5所示是使用峰高计算 ADC 的 DAR 值的结果为4.2，与使用峰面积计算所得值相差不大。使用质谱解卷积结果计算的DAR 值与使用 HIC 液相方法测试的结果 (DAR=4.0)3相近。 图4.使用安捷伦 DAR 计算器计算 ADC 的 DAR (使用峰面积计算) 图5.使用安捷伦 DAR计算器计算 ADC 的 DAR (使用峰高计算) 4 结论 本文使用了非变性条件的天然质谱法检测半胱氨酸连接的抗体药物偶联物(ADC)。此方法能够直接检测到此类 ADC 的分子质量，从而能够对其进行定性。质谱法检测到的此类 ADC 解卷积结果的峰分布与 HIC 液相方法的检测结果相近， DAR 值相差不大，且无需像 HIC 方法需要长时间的液相平衡。安捷伦 DAR 计算器使用简捷方便，仅需要提供很少的参数，就能够自动识别 ADC 的各个峰并计算 DAR， 使 ADC 的 DAR 计算变得更加简单。 ( 参考文献 ) 1.Zhang， H.， et al.， Native mass spectrometry ofphotosynthetic pigment-protein complexes. FEBS Letters，2013.587(8)：p.1012-1020. 2. Valliere-Douglass， J.F.， W.A. McFee， and O. Salas-Solano， Native intact mass determination of antibodiesconjugated with monomethyl Auristatin E and F atinterchain cysteine residues.Anal Chem，2012.84(6)： p. 2843-9. 3. Debaene， F.， et al.， Innovative native MS methodologiesfor antibody drug conjugate characterization： Highresolution native MS and IM-MS for average DAR andDAR distribution assessment. Anal Chem， 2014.86(21)： p.10674-83. 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com.cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年01月15日，中国印刷 5991-6560CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 为研究对象，使用天然质谱法通过 Agilent6530 Q-TOF LC/MS 检测 ADC 的完整分子量，并使用安捷伦DAR计算器软件(Agilent DAR Calculator)计算ADC的加权平均药物/抗体比率(Drug to Antibody Ratio, DAR)。