抗体药物偶联物中药物/抗体比率检测方案(液质联用仪)

使用 UHPLC/Q-TOF 联用系统测定抗体药物偶联物(ADC)的药物/抗体比率 (DAR) 应用简报生物制药 作者左帅 摘要 安捷伦科技(中国)有限公司 本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate， ADC) 为研究对象，使用连接 PLRP-S 反相液相色谱柱的 Agilent 1290 Infinity Ⅱl液相色谱系统分离还原的轻链、重链和相对应连接药物的轻重链， 并通过 Agilent 6530 高分辨率率极杆飞行时间(Q-TOF) 液质联用系统个各个色谱峰进行鉴定。过过积分处理紫外吸收图谱中各轻重链的峰面积百分比，结合各个峰的偶联药物数目，计算ADC 的加权平均药物/抗体比率(Drug to Antibody Ratio， DAR)。同时使用了安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DARCalculator) 对质谱解卷积结果进行 DAR 值计算，所得结果与紫外吸收图谱计算所得结果相同。 前言 抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate， ADC) 是将具有靶向性质的抗体和强细胞毒性的药物通过一个特定化学单元偶联而成的一种新型抗肿瘤药物。 ADC 结合了抗体的靶向特异性与小分子药物的高细胞毒性，可将细胞毒性药物直接送达病变组织，同时限制药物在非目标组织中的毒性，从而达到降低小分子药物毒性或延长小分子药物半衰期的目的。因此，对于癌症的治疗， ADC 具有良好的应用前景。 维布妥昔单抗是一类半胱氨酸连接的抗体药物偶联物，抗体通过部分还原使链间二硫键转换成游离的半胱氨酸残基，半胱氨酸残基再与小分子药连接形成了一种包含 0-8个药物复合抗体的混合物，如图1所示。 图1.半胱氨酸连接的抗体药物偶联物示意图 药物/抗体比率(Drug to Antibody Ratio， DAR) 是所体所连接药物数量的平均值，它能够显著影响 ADC 效果，是衡量 ADC 质量的关键属性。低的 DAR 值可能会导致疗效的下降，而较高的DAR 值又可能会影响 ADC的安全性，因此对ADC DAR 的检测至关重要。 本文以维布妥昔单抗为研究对象，使用反相高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱联用系统，对还原 ADC 的各个组分进行色谱分离、二极管阵列检测器检测和质谱鉴定，并分别通过紫外吸收图谱结果和质谱解卷积结果计算 ADC 的 DAR. 实验部分 材料 维布妥昔单抗为半胱氨酸连接的抗体药物偶联物；二硫苏糖醇购自 Fluka；甲酸购自 Dikma； 三氟乙酸购自 Dikma；乙腈购自Merck Millipore. 仪器 实验在 Agilent UHPLC/Q-TOF 系统上进行，其由配备 PLRP-S反相色谱柱和二极管阵列检测器 (DAD) 的 Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱系统和配备安捷伦双喷射流电喷雾 AJS 源 (ESI+) 的Agilent 6530 高分辨率四极杆飞行时间 (Q-TOF)液质联用系统组成。 样品制备 取 50 pg ADC样品，稀释其浓度至1 mg/mL，加入新鲜配置的二硫苏糖醇(DTT) 储备液， 夜 DTT 的终浓度为 50 mmol/L， 37°C孵育 30 min， 生成还原的 ADC样品。 反相液相色谱条件 色谱柱： PLRP-S色谱柱， 2.1X50 mm， 5 um， 1000A(PN： PL 1912-1502) 流动相： A： 100%水，含0.1%甲酸和0.025%三氟乙酸B：100%乙腈，含0.1%甲酸和0.025%三氟乙酸流速： 0.25 mL/min 梯度： 时间(min) 0 2 3 27 25 49 26 95 31 95 31.5 27 45 27 温度： 70°C 紫外检测波长： 280 nm 质谱条件 干燥气温度： 325°C 干燥气流速： 7 L/min 雾化气压力： 35 psi 鞘气温度： 200 °C 鞘气流速： 4.5 L/min 毛细管电压： 3500V 喷嘴电压： 500 V 碎裂电压： 175V 一级质谱扫描速率： 2 spec/s 一级质谱质量数范围： 500 m/z -5000 m/z 数据分析 使用安捷伦 MassHunter Bioconfirm (版本： B.07.00 Servicepack 1) 对质谱获得的原始结果进行解卷积。所得的解卷积结果导入安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DAR Calculator 1.0)， 在输入/选择 DO质量数和药物/连接物质量数后， DAR 计算器将自动选择、标注并整合具有不同载药量的 ADC 质谱峰组，然后计算平均DAR 并生成峰列表。 结果与讨论 本文使用DTT 对维布妥昔单抗进行还原，将其解离为带有0到1个药物的轻链以及带有0到3个药物的重链，并利用反相色谱系统基于疏水性差异对还原的轻链、重链和相对应连接药物的轻重链进行有效分离。通过反相色谱-质谱联用技术对还原 ADC的各个峰进行质谱鉴定，所得原始结果经安捷伦 MassHunterBioconfirm 解卷积后，导入安捷伦 DAR 计算器进行ADC 的加权平均 DAR 的计算。如图2所示是反相色谱分离还原 ADC 的的谱总离子流色谱图，分别提取每个峰的质谱图并解卷积。如图3所示为峰 a、b的质谱解卷积结果，可以看出峰 a 为 ADC的轻链 (LC)；峰b质谱图解卷积结果中质量数为25041.4 Da 的峰为连接有一个小分子药物的轻链(LC-1d)，而 24279.29 Da 的峰是连接了化学单元 (linker) 的轻链(LC-linker)， 这可能是由于样品在源内离子化过程中，小分子药物从样品上部分脱落导致的，因此峰b 是连接了一个小分子药物的轻链(LC-1d)。对峰 c、d、e、f的质谱图进行解解积(图4)，可以看出它们分别对应了 ADC 的重链(HC)、重链上连接一个小分子药物 (HC-1d)、重链连接两个小分子药物(HC-2d)以及重链连接三个小分子药物(HC-3d)。对小峰d'、e'、f'的质谱图进行解卷积，其结果相对于主峰多几个道尔顿，是由于有小部分的链内二硫键发生了还原所致。 图2.反相色谱分离还原ADC 的质谱总离子流色谱图 图4.峰c、d、e、f的解卷积结果 通过质谱鉴定可以确定反相色谱分离还原ADC 的紫外吸收谱图中各个峰的归属(图5)，通过对峰面积进行积分，计算轻链峰的峰面积百分比，且峰面积百分比总和为100；计算重链峰的峰面积百分比，且总和为100。根据公式DAR=2X(重链加权峰面积+轻链加权峰面积)/100"，最终计算出该 ADC 一维布妥昔单抗的加权平均DAR 值为4.0(如表1所示)，与文献报道相同". 图5.反相色谱分离的还原 ADC 在 280 nm 处的紫外吸收谱图及各峰的积分面积(右上) 表1.还原 ADC 的加权平均 DAR 计算列表' 峰名 药物负荷 峰面积百分比(%) 加权峰面积(药物负荷X峰面积)/% LC 0 43.3 0 LC-1d 1 56.7 56.7 HC 0 19.9 HC-1d 1 36.1 36.1 HC-2d 2 25.4 50.8 HC-3d 3 18.6 55.8 加权平均 DAR 4.0 使用色谱图峰面积计算 将质谱所得的轻重链图谱分别解卷积，并将解卷积结果导入安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DAR Calculator) 中， 自动计算 ADC 的 DAR。如图6所示，手动分别选择轻链 DAR 0、DAR 1和重链 DAR 0- DAR 3的峰，软件会自动计算轻链与重链的 DAR， 并给出 ADC 的最终加味平均 DAR。 安捷伦 DAR 计算器计算所得的 ADC 的加权平均DAR直为4.0，与液相方法所测结果一致。 图6.使用安捷伦 DAR 计算器计算 ADC的 DAR 结论 本文使用反相色谱质谱联用技术对还原 ADC 的各个片段进行分离和检测，从而计算 ADC 的加权平均 DAR。 PLRP-S色谱柱能够轻松实现对 ADC 各个还原片段的分离；质谱联用技术可对各峰进行归属；通过计算 ADC 紫外吸收光谱结果中各峰的峰面积百分比，最终得到 ADC 的加权平均 DAR；基于质谱结果，通过安捷伦 DAR 计算器计算 ADC 的加权平均 DAR。与传统的HIC 方法相比， RP-HPLC的方法没有高浓度盐，不会对常规液相色谱系统造成污染，使用的是质谱兼容的流动相，能够同时兼顾质谱定性与液相色谱定量对流动相的要求，此方法可与 HIC 方法互为补充并相互印证。安捷伦 DAR 计算器能够自动计算 ADC 的 DAR 值，此值与液相方法所测结果一致，且计算过程更加简捷。 ( 参考文献 ) ( 1. Debaene， F . ， et al.， Innovative native MS methodologies for antibody drug conjugate characterization： High resolution native MS and IM-MS for average DAR andDAR distribution assessment. Anal Chem， 2014. 8 6(21)： p. 10674-83 ) ( 2. Ducry， Laurent， et al.， Antibody-Drug Conjugates.Methods in Molecular Biology， 2013.高凯等译， 抗体偶联药物，科学出版社，国字01-2014-8238号 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com.cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年01月11日，中国印刷 5991-6559CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 为研究对象，使用连接 PLRP-S 反相液相色谱柱的 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统分离还原的轻链、重链和相对应连接药物的轻重链，并通过 Agilent 6530 高分辨率四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统对各个色谱峰进行鉴定。通过积分处理紫外吸收图谱中各轻重链的峰面积百分比，结合各个峰的偶联药物数目，计算ADC的加权平均药物/抗体比率 (Drug to Antibody Ratio, DAR)。同时使用了安捷伦DAR 计算器 (Agilent DARCalculator)对质谱解卷积结果进行 DAR 值计算，所得结果与紫外吸收图谱计算所得结果相同。