利用LCMS对mRNA和DNA生产用核苷酸原料进行定性分析

本文采用Nexera XS Inert生物惰性超高效液相色谱和单四极杆质谱LCMS-2050联用仪对mRNA和DNA生产用核苷酸原料进行定性分析，利用液相色谱进行分离，单四极杆质谱检测原料的分子量。该方法无需复杂的样品前处理、操作简单、分析速度快，可分离出原料中杂质，结果可靠，适用于mRNA和DNA原料进厂质控分析，可对其原料进行快速分子量确认。SSL-CA23-198 Excellence in ScienceLCMS-048 利用 LCMS 对 mRNA 和 DNA 生产用核苷酸 原料进行定性分析 LCMS-048 摘要：本文采用 Nexera XS Inert 生物惰性超高效液相色谱和单四极杆质谱 LCMS-2050 联用仪对 mRNA和 DNA 生产用核苷酸原料 NTP 和 dNTP 进行定性分析。NTP和dNTP 中含磷酸基团，易与金属产生吸附作用， Nexera XS Inert 在保证超高耐压的前提下，管路经 peek 材料内衬，实现全流路惰性化，抑制金属吸附，使NTP 和 dNTP 的色谱峰型良好。通过优化流动相和质谱采集参数，采用 DUIS (ESI+APCI) 离子源的负离子模式分析 待测样品。结果显示，该方法无需复杂的样品前处理、操作简单，检测的 NTP 和 dNTP 色谱峰型良好且均有较 好的保留，适用于 mRNA 和 DNA原料进厂质控分析，可对其原料进行快速分子量确认。 关键词：mRNA DNA 原料 NTPP(dNTP 技术特点： 必 Nexera XS Inert 和 LCMS-2050联用可抑制金属吸附，峰型良好，获得分子量信息。 必本方法无需复杂的样品前处理，操作简便，分析速度快，可以进行高通量检测。 核苷三磷酸 (NTP) 是一种含有三个磷酸基团的核 苷酸，包括 ATP、UTP、CTP、GTP， 是 mRNA生产过 程中体外转录的原料。若将 NTP 中核糖替换成去氧核 糖，那么会使核苷三磷酸变成去氧核苷三磷酸(dNTP)，包 括 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP。 dNTP 是合成 DNA的原料，常用于 PCR、qPCR、RT-PCR、cDNA或 普通 DNA 合成、引物延伸反应、DNA测序、DNA 标记 等各种常规分子生物反应。核苷酸原料的检测与分析是 mRNA 和 DNA 生产物料质控的重要一环。 NTP 和 dNTP 中含磷酸基团，若使用常规高效液 相色谱仪分析，易与系统中不锈钢管路等金属部件产生 吸附作用，影响色谱峰峰形，且易产生残留。岛津最新 推出 Nexera XS Inert 生物惰性超高效液相色谱仪，在 保证超高耐压的前提下，管路经 peek 材料内衬，实现 全流路惰性化，抑制金属吸附，使 NTP 和 dNTP的色 谱峰型良好。 本实验采用 Nexera XS Inert 生物惰性超高效液相 色谱和单四极杆质谱 LCMS-2050 联用仪对 mRNA 和 DNA 生产用核苷酸原料进行定性分析，无需复杂的样 品前处理、操作简单、分析速度快，适用于 mRNA 和 DNA原料进厂质控分析，可对其原料进行快速分子量 确认。 1.1仪器 Nexera XS Inert 生物惰性超高效液相色谱与单四极杆质谱 LCMS-2050 联用系统，具体配置信息如下： 系统控制器 CBM-40 自动进样器：SIL-40C XSi 脱气机：DGU-405输液泵 ：LC-40D XSi×2 柱温箱 CTO-40C 质谱仪：：LCMS-2050 单四极杆质谱仪 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.114 图1单四极杆液质联用仪 LCMS-2050 1.2分析条件 色谱 柱 Shim-Pack Scepter C18-120 [Metal free] (50 mm×2.1 mm l.D.， 3um))，岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 227-31073-01) 流 动相日： A相-10mM DIPEA+25mM HFIP，B相-甲醇 进样体积：5pL 温： 40°C 流 速点：0.3mL/min 柱 洗针液： 甲醇/水=1：1 (v：v) 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为0%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 0 3 Pumps Pump B Conc. 30 4 Pumps Pump B Conc. 30 4.1 Pumps Pump B Conc. 0 8.00 Control Stop 质谱条件 离 子 源：DUIS(ESI+APCI)雾化气流速：2.0 L/min DL温 度：2250°℃干燥气流充速速：：5.0L/min 脱溶剂温度：300℃加热气流速：7.0L/min 扫描模式：Scan (-)扫描范围：：200~600 1.3样品前处理方法 将 NTP 和 dNTP 样品用水溶解，并稀释至100 umol/L。 ■结果与讨论 2.1 mRNA 体外转录原料 NTP分子量及分析结果 对 mRNA 体外转录原料 ATP、GTP、CTP、UTP进行检测，总离子流图和质谱图见图2，核苷酸的分子式、理论 分子量、实测分子量见表2。其中 ATP检测到m/z 506.1 峰、GTP 检测到 m/z 522.1 峰、CTP 检测到 m/z 482.1峰、GTP 检测到 m/z 483.1峰，均为[M-H]峰。 表2NTP 分子式及分子量检测结果 序号 名称 分子式 分子量 实测值 1 ATP C10H16N5O13P3 507.0 506.1 2 GTP C10H16N5O14P3 523.0 522.1 3 CTP C9H16N3O14P3 483.0 482.1 4 UTP CgH1sN2O1sP3 484.0 483.1 2500000-1：TIC(-) Inten.(x100，000)4.02000000506.13.015000002.01000000500000 1.00-488.13.0 min 450 500 550 m/z la. ATP 总离子流色谱图和质谱图 Inten. (x100，000)1：TIC(-) 42500000522.120000003.015000002.0100000051.00一00000523.0504.10-2.0 3.0 min 500 550 m/z 1b. GTP 总离子流色谱图和质谱图 1：TIC(-) Inten.(x100，000)1500000 2.0482.11.510000001.0-5000000.5464.10 0.0450 500 550 m/z0.7 2.5 min lc. CTP总离子流色谱图和质谱图 ld. UTP 总离子流色谱图和质谱图 图2 NTP 总离子流色谱图和质谱图 2.2聚合酶链式反应生产 DNA 药物原料dNTP分子量及分析结果 对聚合酶链式反应生产 DNA 药物原料 dATP、dGTP、dCTP、dTTP进行检测，总离子流图和质谱图见图3，脱 氧核苷酸的分子式、理论分子量、实测分子量见表3。其中 dATP 检测到 m/z 490.1 峰、dGTP检测到 m/z 506.1峰、dCTP 检测到 m/z 466.1 峰、dGTP 检测到 m/z 481.1峰，均为[M-H]峰。 表3CdNTP 分子式及分子量检测结果 序号 名称 分子式 分子量 实测值 1 dATP C10H16N5O12P3 491.0 490.1 2 dGTP C10H16N，O13P3 507.0 506.1 3 dCTP C。H16N：O13P3 467.0 467.1 4 dTTP C10H17N，O14P3 482.0 482.1 3：TIC(-) Inten.(x1，000，000)3.07500000 2.5一490.1一2.05000000-1.52500000 1.0一 0.50- 472.10.03.5 min 450.0 475.0 500.0 m/z 2a. dATP 总离子流色谱图和质谱图 2b. dGTP 总离子流色谱图和质谱图 2c. dCTP 总离子流色谱图和质谱图 LCMS-048 2d. dTTP 总离子流色谱图和质谱图 图3 dNTP 总离子流色谱图和质谱图 结论 本文采用 Nexera XS Inert 生物惰性超高效液相色谱和单四极杆质谱 LCMS-2050 联用仪对 mRNA 和 DNA生产用 核苷酸原料进行定性分析，利用液相色谱进行分离，单四极杆质谱检测原料的分子量。该方法无需复杂的样品前处理、操作简单、分析速度快，可分离出原料中杂质，结果可靠，适用于 mRNA 和 DNA 原料进厂质控分析，可对其原料 进行快速分子量确认。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心 Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications Center